Reconocimiento-NoComercial 4.0 Internacional Esta licencia permite a otras distribuir, combinar, retocar, y crear a partir de su obra de forma no comercial y, a pesar que son nuevas obras deben siempre rendir crédito y ser no comerciales, no están obligadas a licenciar sus obras derivadas bajo los mismos términos. http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0 http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/ http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0 http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/ UNIVERSIDAD NACIONAL “SAN LUIS GONZAGA” VICERRECTORADO DE INVESTIGACIÓN Facultad de Farmacia y Bioquímica Efectividad nematicida In Vitro del alga marina Lessonia nigrescens sobre el nemátodo Meloidogyne spp. en plantas de Solanum lycopersicum en el distrito de Ica. Línea de investigación Salud Pública y Conservación del Medio Ambiente INFORME FINAL DE TESIS Bach. Ariana Del Carmen Ochoa Lizarzaburo Ica, Perú 2024 ii DEDICATORIA Los tiempos de Dios son perfectos. Dios me ha guiado y me ha dado la fortaleza para seguir adelante. A mis padres, por su apoyo incondicional y haberme formado con buenos valores, hábitos y convicciones lo cual me ha ayudado a seguir adelante en los momentos difíciles. A mi hermana y mi ángel, quienes son mi mayor motivación para nunca rendirme en los estudios y poder llegar a ser un ejemplo para ella. iii AGRADECIMIENTO Mis cordiales y profundos agradecimiento a la Asociación Científica de Investigación Farmacéutica (ACIF), Dra. Haydee Chávez Orellana fundadora de este prestigioso semillero, Dr. Felipe Surco Laos y el Ing. Ricardo Espino Caballero; a cada uno de los docentes que han sido parte de toda mi vida universitaria compartiendo sus conocimientos profesionales y de vida. Asimismo, mi enorme agradecimiento a cada hermano egresado acifano y a mis compañeros de promoción por el apoyo incondicional brindado en este camino de formación universitaria. iv ÍNDICE DE CONTENIDO RESUMEN 8 ABSTRACT 9 I. INTRODUCCIÓN 10 1.1. Descripción de la Realidad Problemática 10 1.2. Formulación del problema 10 1.3. Justificación e importancia del problema 10 1.4. Objetivos 11 1.5. Hipótesis y variables de la investigación 12 1.6. Marco teórico 12 1.6.1. Antecedentes de la investigación 12 1.6.2. Lessonia nigrescens 16 1.6.3. Meloidogyne spp 19 1.6.4. Extractos vegetales 19 1.6.5. Cromatografía de capa fina 21 II. ESTRATEGIA METODOLÓGICA 22 2.1. Tipo y diseño de la investigación 22 2.2. Lugar de la investigación 22 2.3. Materiales y métodos 22 2.4. Población 24 2.5. Muestra 24 2.6. Metodología 24 2.6.1. Recolección y preparación de las muestras 24 2.6.2. Identificación de metabolitos secundarios en los extractos etanólicos de 25 Lessonia nigrescens (arcanto) 2.6.3. Ensayos in vitro 28 2.6.4. Prueba de Bioensayo en las plantas de tomate 29 III. RESULTADOS 35 IV. DISCUSIÓN 51 V. CONCLUSIONES 53 VI. RECOMENDACIONES 54 VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 55 VIII. ANEXOS 61 v ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Clasificación Taxonómica 17 Tabla 2. Tratamientos usados para el control del nemátodo Meloidogyne spp 31 en plantas de tomate. Tabla 3. Porcentajes de mortandad de Meloidogyne spp producida por el extracto 44 etanólico de las hojas de Lessonia nigrescens a diferentes concentraciones. Tabla 4. Concentración Letal Media del extracto etanólico de las hojas de 44 Lessonia nigrescens en el ensayo in vitro. Tabla 5. Efectos biométricos sobre plantas de tomate de los extractos etanólicos 46 de las hojas y talos de Lessonia nigrescens a diferentes concentraciones, tratamiento químico, orgánico, inoculado en comparación con el testigo control. Tabla 6. Concentración Letal Media del extracto etanólico de las hojas de 48 Lessonia nigrescens en el bionsayo en plantas de tomate. vi ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Lessonia nigrescens. 16 Figura 2. Distribución geográfica del género Lessonia. 18 Figura 3. Identificación de flavonoides en los extractos etanólicos de Lessonia nigrescens. 36 Figura 4. Identificación de Aminoácidos en los extractos etanólicos de Lessonia nigrescens. 36 Figura 5. Identificación de Grupos fenólicos libres en los extractos etanólicos de 37 Lessonia nigrescens. Figura 6. Identificación de taninos en los extractos etanólicos de Lessonia nigrescens. 38 Figura 7. Identificación de triterpenos y/o esteroides en los extractos etanólicos 38 de Lessonia nigrescens. Figura 8. Identificación de alcaloides en los extractos etanólicos de Lessonia nigrescens. 39 Figura 9. Identificación de leucoantocianidinas y catequinas en los extractos etanólicos de 40 Lessonia nigrescens. Figura 10. Identificación de antraquinonas en los extractos etanólicos de Lessonia 40 nigrescens. Figura 11. Identificación de cardenólicos en los extractos etanólicos de Lessonia nigrescens. 41 Figura 12. Identificación de saponinas en las muestras de Lessonia nigrescens. 42 Figura 13. Identificación de principales familias de metabolitos secundarios 42 en los extractos de Lessonia nigrescens. Figura 14. Porcentajes de mortandad in vitro de Meloidogyne spp por el efecto nematicida 43 de los extractos de Lessonia nigrescens (hojas y talos). Figura 15. Porcentajes de mortandad de Meloidogyne spp producida por el extracto 45 etanólico de las hojas de Lessonia nigrescens a diferentes concentraciones. Figura 16. Porcentaje de mortandad del bioensayo en plantas de tomate de 47 Meloidogyne spp producida por los extractos etanólicos de hojas y talos del alga Lessonia nigrescens a diferentes concentraciones. Figura 17. Número de individuos J2 de Meloidogyne spp / 100 cc de suelo en las 3 47 evaluaciones del tratamiento con mayor efectividad nematicida en comparación con el testigo químico, orgánico e inoculado. Figura 18. Resultados del peso de las raíces de tomate (g) que fueron evaluados 48 al finalizar el tratamiento con los extractos etanólicos de Lessonia nigrescens (hojas y talos) en diferentes concentraciones testigo químico y testigo orgánico. Figura 19. Resultados de la longitud de las raíces de tomate que fueron evaluados 49 al finalizar el tratamiento con los extractos etanólicos de Lessonia nigrescens (hojas y talos) en diferentes concentraciones testigo químico y testigo orgánico. vii Figura 20. Resultados del peso del follaje fresco de tomates que fueron 49 evaluados al finalizar el tratamiento con los extractos etanólicos de Lessonia nigrescens (hojas y talos) en diferentes concentraciones testigo químico y testigo orgánico. Figura 21. Resultados de la longitud del follaje fresco de tomates que fueron 50 evaluados al finalizar el tratamiento con los extractos etanólicos de Lessonia nigrescens (hojas y talos) en diferentes concentraciones testigo químico y testigo orgánico. viii RESUMEN En la actualidad, para llevar un control en las plagas existentes en los cultivos, se utilizan métodos químicos, siendo esto muy perjudicial para el ecosistema y la salud de la población. El principal responsable de afectar estos cultivos es el nematodo Meloidogyne spp, encontrándose distribuido en todos los campos de la región. El objetivo de nuestra investigación fue evaluar el efecto nematicida in vitro del alga marina Lessonia nigrescens sobre el nematodo Meloidogyne spp en plantas de tomate, siendo estas muy susceptibles a su infestación, ya que en estudios previos se ha demostrado que las algas marinas ofrecen un potencial sostenible para disminuir el uso de pesticidas químicos, por ser estas un recurso abundante en nuestra región. Como resultado del presente trabajo se ha demostrado el efecto nematicida del extracto etanólico de Lessonia nigrescens (a concentraciones de 1, 10, 50, 100%), siendo las hojas las de mayor efecto a la concentración del 50%, no habiendo diferencias estadísticamente significativas (P>0.05) con las concentraciones más elevadas. En el ensayo realizado en las plántulas de tomate, el extracto a la misma concentración ocasionó mayor efecto mortal para Meloidogyne spp y mayor efecto biofertilizante para los estos cultivos. Como conclusión podemos indicar que el alga Lessonia nigrescens es una muy buena alternativa para el control del nematodo Meloidogyne spp, determinándose su efectividad in vitro. Palabras claves: Alga, Lessonia nigrescens, Meloidogyne spp, nematicida, extracto etanólico. ix ABSTRACT Currently, to control pests in crops, chemical methods are used, which is very harmful to the ecosystem and the health of the population. The main person responsible for affecting these crops is the nematode Meloidogyne spp, which is distributed in all fields in the region. The objective of our research was to evaluate the in vitro nematicidal effect of the seaweed Lessonia nigrescens on the nematode Meloidogyne spp in tomato plants, these being very susceptible to its infestation, since previous studies have shown that seaweeds offer a potential sustainable to reduce the use of chemical pesticides, as these are an abundant resource in our region. As a result of this work, the nematicidal effect of the ethanolic extract of Lessonia nigrescens has been demonstrated (at concentrations of 1, 10, 50, 100%), with the leaves having the greatest effect at a concentration of 50%, with no statistically significant differences. (P>0.05) with the highest concentrations. In the test carried out on tomato seedlings, the extract at the same concentration caused a greater lethal effect for Meloidogyne spp and a greater biofertilizing effect for these crops. In conclusion we can indicate that the algae Lessonia nigrescens is a very good alternative for the control of the nematode Meloidogyne spp, determining its effectiveness in vitro. Keywords: Seaweed, Lessonia nigrescens, Meloidogyne spp, nematicide, ethanolic extract. 10 I. INTRODUCCIÓN 1.1. Descripción de la Realidad Problemática La región de Ica ha sido impulsada por numerosos sectores económicos, uno de los más importantes, y con un notable crecimiento año a año, es la agroexportación. Esta actividad ha significado una importante fuente de empleo para los ciudadanos tratando de sumarse a una de las grandes soluciones para disminuir la pobreza en el Perú. Ica cuenta con 254 mil hectáreas de tierras con aptitud agrícola, pero sola una fracción de éstas son destinadas a los productos de la agroexportación. Destacan muchos cultivos de exportación entre ellas es la uva, cultivo que representa significativamente a esta región con más de 17 mil hectáreas cosechadas en el 2020, así como también cultivos de espárragos, algodón, maíz, palta, cebolla y tomate1, sobre todo éste último se ha visto afectado enormemente por el nematodo Meloidogyne, debido a que éste género se encuentra distribuido en todos los campos agrícolas de la región y del mundo causando numerosos daños y pérdidas en los cultivos. Este nematodo fitoparásito puede generar deformaciones en las raíces (nódulos) variando su tamaño dependiendo del hospedero, también ocasiona lesiones necróticas, rajadura en órganos subterráneos, entre otros2. 1.2. Formulación del problema Frente a todo lo mencionado, el planteamiento del problema para la presente investigación respondió a la pregunta: ¿Tendrá el extracto etanólico del alga Lessonia nigrescens efecto nematicida in vitro sobre Meloidogyne spp en plantas de Solanum licopersicum? 1.3. Justificación e importancia del problema A lo largo de los años se ha cuestionado el control que han tenido los nematodos fitopatógenos con agentes biocidas químicos en las plantaciones del cultivo debido principalmente a estas razones: su alto costo y los efectos adversos por su toxicidad que genera en el ecosistema y en los productos que se obtiene de ellos para el consumo humano3. En diversas investigaciones se han obtenido información sobre sustancias en distintas plantas que presentan efecto nematicida o nematostático identificadas como: alcaloides, que produce un bloqueo de la trasducción de la señal neuronal de insectos y vertebrados; los terpenoides, que forman una masa 11 semicristalina que sella la herida y atrapa al microorganismo patógeno y a los fenilpropanoides, que en su forma insoluble refuerza la pared celular de las plantas en respuesta de un ataque. Una de las principales propiedades de los metabolitos secundarios presentes en las plantas es su defensa frente a los predadores lo que les permite resistir a la agresión de cualquier plaga4. Debido al conocimiento de antemano sobre el control de plagas a nivel mundial con los extractos de algas por la presencia de los siguientes compuestos: ácidos algínicos, kaínicos, terpenos, isotiocianatos, alcaloides, etc., se justifica el estudio ya que a nivel local se tiene poca información y uso, teniendo un valor agregado de ser utilizado como biofertilizante y contribuirá a una agricultura más orgánica5. Importancia El desarrollo de la presente investigación permitirá adquirir conocimientos básicos sobre el efecto nematicida de la especie Lessonia nigrescens, ya que todo ello supone un esfuerzo por despertar un interés por parte de la industria agrícola, para el uso de pesticidas naturales; así como en industrias agroexportadoras, debido a que cada vez existe una mayor demanda de alimentos de origen orgánico libres de pesticidas químicos, permitiendo a las empresas tener menor costo en los tratamientos de sus cultivos y mayor ingreso impulsando la economía del sector. 1.4. Objetivos 1.4.1. Objetivo general Determinar el efecto nematicida in vitro del alga marina Lessonia nigrescens en plantas de Solanum licopersicum 1.4.2. Objetivos Específicos - Identificar los metabolitos secundarios presentes en el extracto etanólico del alga Lessonia nigrescens mediante un screening fitoquímico. - Evaluar la actividad nematicida in vitro del extracto del alga marina y extractos vegetales a diferentes concentraciones sobre Meloidogyne spp. 12 1.5. Hipótesis y variables de la investigación 1.5.1. Hipótesis El extracto etanólico del alga marina Lessonia nigrescens posee efecto nematicida o nematostático sobre Meloidogyne spp. 1.5.2. Variables: 1.5.2.1. Variables dependientes - Eficacia nematicida - Metabolitos secundarios - Indicadores de variables dependientes - Juveniles 2 y huevos de Meloidogyne spp. 1.5.2.2. Variables independientes - Extractos etanólico del alga Lessonia nigrescens. - Indicadores de variables independientes. - Metabolitos secundarios del alga Lessonia nigrescens. 1.6. Marco teórico 1.6.1. Antecedentes de la investigación Internacional: - Dina SS Ibrahim, et al. En el 2021, realizó una investigación titulada “Propiedades nematicidas de extractos metanólicos de dos algas marinas contra el nematodo agallador de la raíz del tomate, Meloidogyne incognita”, en donde evaluaron dos algas para el control de la infección en plantas de tomate: el alga roja Phacelocarpus tristichus J. Agardh y el alga parda Turbinaria ornata J. Agardh en 3 concentraciones (0.5; 1.0 y 2%). Teniendo como resultado que los extractos metanólicos de las dos especies mejoraron los parámetros de crecimiento de las plantas infectadas y no infectadas, asimismo, manifestaron actividades nematicidas contra M. incognita. Sin embargo, Turbinaria ornata superó a Phacelocarpus tristichus, recomendándose como biofertilizantes en el manejo integrado del M. incognita6. 13 - Ping Zou et al. En el 2019 realizaron este estudio titulado “Polisacáridos derivados del alga parda Lessonia nigrescens mejoran la tolerancia al estrés abiótico de las plántulas de trigo al mejorar el sistema antioxidante y modulación de la concentración de iones intracelulares”, concluyendo que los polisacáridos del alga parda Lessonia nigrescens (LNP) mejoraron el crecimiento de los cultivos y la resistencia de las plantas al estrés abiótico. Obtuvieron y caracterizaron dos polisacáridos ácidos a partir del extracto crudo de LNP. Demostrando que esta promueve el crecimiento de las plantas, disminuye la peroxidación lipídica de la membrana, aumentando el contenido de clorofila, mejorando las actividades antioxidantes, coordinando la salida y la compartimentación de iones intracelulares. Estos polisacáridos inducen la resistencia de las plantas al estrés salino7. - El-Eslamboly et al. En el 2019 realizaron un estudio titulado “Aplicación de algas como método de control biológico del nematodo agallador Meloidogyne incognita en pepino en condiciones de cultivo protegidas y su impacto en el rendimiento y la calidad de la fruta”, con la finalidad de controlar el nematodo agallador Meloidogyne incognita en pepino, probaron varios tratamientos con las algas Spirulina y Amphora, después de 15 días desde el trasplante, aplicaron nuevamente los tratamientos 2 veces al mes durante 3 meses. Como resultado, el suelo tratado con los extractos de Amphora o Spirulina tuvo incrementos significativos en el crecimiento vegetativo y la calidad del fruto. Sin embargo, el tratamiento con Amphora fue más efectivo en el control de nematodos o en potenciar resistencia de las plantas a los nematodos. Concluyendo la efectividad, de las algas para el control biológico del nematodo agallador Meloidogyne spp8. - Chao Zhao et al. En el 2017 realizaron el estudio titulado “Eficacia regulatoria del extracto de alga parda Lessonia nigrescens en el perfil de expresión genética y la microflora intestinal en ratones diabéticos tipo 2”, investigaron la actividad antidiabética del extracto etanólico (LNE) de Lessonia nigrescens en ratones diabéticos tipo 2, demostraron que los niveles de glucosa en sangre en ayunas disminuyeron significativamente después de la administración de LNE, indicando que podría proteger la arquitectura celular del hígado y el riñón. El tratamiento con LNE aumenta significativamente las poblaciones de Bacteroidetes y disminuye las 14 Firmicutes en la microflora intestinal. Considerando a LNE como un alimento funcional para reducir la glucosa en sangre y regular la microflora intestinal9. - Iler Iler Diana Carolina en el 2017 en su tesis titulada “Evaluación de la actividad nematicida in vitro de aceites esenciales frente a Meloidogyne.”, tuvo como objetivo evaluar la actividad nematicida in vitro de los aceites esenciales de eucalipto, romero, tomillo, orégano, demostrando que el aceite de tomillo y romero presentaron una mortalidad del 100 % a las 24 y 8 horas de exposición respectivamente frente a nematodos juveniles en segundo estadío extraídos de raíces de tomate10. - Martinotti, Marcelos Diego et al. En el 2016 realizaron el estudio titulado “ Efecto Nematicida de extractos de ajo, orujos de uva y alperujo de aceituna; sobre Meloidogyne incognita”, compararon el efecto de extractos acuosos de bulbillos de ajo, de compost inmaduro de alperujo de aceituna, de compost inmaduro de orujo de uva fresca y de compost inmaduro de orujo de uva agotado, sobre el índice de agallamiento, el índice de reproducción de huevos y juveniles J2 y la población final de hembra de M. incognita, en plantas de vid; obteniendo como resultado que el extracto de los bulbillos de ajo tuvo una disminución notable en todos los parámetros que se quisieron demostrar en el presente estudio11. Nacional: - De la revisión bibliográfica realizada a nivel nacional no se encontró trabajos sobre la evaluación del uso de extractos de algas sobre nematodos. Sin embargo, existen numerosos trabajos en donde se ha utilizado nematicidas biológicos a base de plantas, hongos, etc. para el control de poblaciones del género Meloidogyne presentes en diferentes cultivos de: quinua, maíz, entre otros cultivos.12 13 - Cruzados-Campos Jackeline en el 2021 en su tesis titulada “Aplicación foliar de algas marinas en el Rendimiento y la calidad en dos cultivares de melón (Cucumis melo L.) en la Molina”, determinó el efecto de la aplicación foliar de algas marinas Fertimar (100% a base de algas Lessonia nigrescens y Lessonia trabeculata) en el desarrollo fenológico, rendimiento, calidad y viabilidad económica, en dos cultivares de melón Rina F1 (var. reticulatus) y Steego F1 (var inodorus), en Costa Central, bajo riego por goteo. La respuesta en rendimiento comercial y no comercial, calidad del fruto, 15 crecimiento y desarrollo de ambos cultivares fue significativa, asimismo, incrementó el índice de rentabilidad, convirtiéndose en una alternativa orgánica económicamente viable14. Local: - Solier Allcca Sonia y Rimache Allcca Wilson en el 2019 en su trabajo de tesis titulada “Efecto de la aplicación foliar de tres fuentes de algas marinas en diferentes dosis en el cultivo de sandía (Citrullis lanatus L.) hibrido Santa Amalia en la zona media de valle de Ica”, determinaron el mejor producto y dosis de extracto de algas marinas, aplicados al área foliar. En el rendimiento de sandía, encontraron diferencia estadística, en los tratamientos en estudio destacando los productos Algas (Ascophyllum nodosum) y Algamar (Lessonia nigrescens) con la dosis de 6.0 L/ha, observándose el efecto positivo, superando ampliamente al testigo quien obtuvo una baja producción. La mayor rentabilidad desde el punto de vista económico la obtuvo el tratamiento (Algax, Ascophyllum nodosum 6.0 L/ha)15. - Huaroto Palacios Lorena y Valdivia Pillaca María en el 2018 en su trabajo de tesis titulada “Efectividad Nematicida de Paecilomyces lilacinus sobre el cultivo de Vitis vinífera y Capsicum annuum, infestados con Meloidogyne spp. “Nematodo del Nódulo” Mayo a Agosto del 2018”, evaluaron a través de ensayos in vitro la reducción de la población de Meloidogyne spp en un 47% de J2, huevos en un 73% y hembras en 28% a un nivel manejable. Se tuvo como conclusión que Paecilomyces lilacinus es eficaz para el control de Meloidogyne en la prueba de campo16. - Galindo, Ruth en el 2011, en su trabajo de tesis titulada “Efecto nematicida in vitro y en plantas de tomate de algas marinas Colpomenia sinuosa, Gracilariopsis lemaneiformis y Ulva papenfussii de la Bahía de Paracas sobre Meloidogyne incognita” evaluó el efecto de diversos extractos de las algas: Colpomenia sinuosa, Gracilariopsis lemaneiformis y Ulva papenfussii a concentraciones de 10, 50 y 100 %, como una alternativa más ecológica para el control del nematodo M. incognita, encontrando acción nematicida in vitro en las tres especies, teniendo un mayor efecto la Ulva papenfussii, con la concentración más efectiva del 10 % para los extractos probados (metanólico, acuoso y etanólico)17. 16 - Varas, Noemí en el 2011, en su tesis titulada “Evaluación de la efectividad de extracto de Bidens pilosa L. para el control de Meloidogyne incognita (Kofoid y White) Chitwood en Lycopersicum esculentum variedad Rio Grande tomate in vitro y el tinglado en el Valle de Ica” realizó el estudio fitoquímico de extracto y actividad nematóxica de extractos de Bidens pilosa L. para el control de Meloidogyne incognita (Kofoid y White) Chitwood, In vitro y el tinglado con tomate variedad Rio Grande, en donde se identificó los siguientes metabolitos secundarios: alcaloides, flavonoides catequinas grupos fenólicos libres y triterpenoides y/o esteroides, atranquinonas, leucoantocianidinas, siendo negativo para taninos y saponinas. Encontró que en la efectividad in vitro existe diferencia significativa entre cada dosis y los tipos de extracción, por lo que demostró su eficiente actividad tanto en el estadío juvenil como huevo, resultando ser más efectiva, el extracto por flujo etanólico (ERE) desde las dosis 1.5% en las tres pruebas de comparación con los demás tratamientos18. 1.6.2. Lessonia nigrescens: - Generalidades Es una macroalga parda que alcanza hasta 4 metros de longitud y pertenece a la familia Lessoniaceae, más conocida en el Perú como arcanto, negra o cabeza, que pertenecen al orden de laminariales que geográficamente se encuentran ubicadas en las costas del Océano Pacífico de Sudamérica.14 19 Presenta un rizoide de hasta 20 cm de diámetro de donde nacen uno o más ejes principales surgiendo de cada eje, láminas20. Estas algas se han caracterizado por presentar una gran cantidad de proteínas, oligoelementos, mucílagos y vitaminas; siendo su principal empleo en la alimentación humana.19 17 Figura 1. Lessonia nigrescens - Clasificación botánica La identificación botánica fue realizada por el biólogo David Miranda Huamán de la Universidad Nacional San Luis Gonzaga; según el sistema de Clasificación de Guiry, M.D, & Guiry, G.M, (2018). (Ver anexo 1.) Tabla 1. Clasificación Taxonómica Lessonia nigrescens Bory de Sant-Vincent - Distribución Geográfica Se encuentra ubicado en Sudamérica en la costa de Océano Pacífico Este del hemisferio sur, distribuida desde la provincia de Callao (Perú), hasta el cabo de TAXONOMÍA Reino PROTISTA División OCHROPHYTA Clase PHAEOPHYCEAE Orden LAMINARIALES Familia LESSONIACEAE Género Lessonia Especie Lessonia nigrescens Bory de Sant-Vicent Nombre vulgar: arcanto negro 18 Hornos (Chile). Domina las aguas frías de ambos hemisferios, ubicándose en las Islas Malvinas, Islas Heard y Kerguelen.21 22 - Hábitat Su distribución es intermareal y se localiza con mayor frecuencia en la zona marítima de las regiones de Ica, Arequipa, Moquegua y Tacna14. Modifican la estructura y funcionamiento de la biodiversidad en los sistemas costeros someros donde se desarrollan, por lo que son considerados ingenieros ecosistémicos estructuradores de hábitats, que proveen sustrato para el asentamiento larval, reclutamiento de juveniles, región y hábitat para especies de macro invertebrados y peces20. Figura 2. Distribución geográfica del género Lessonia Fuente. Clare (1993)23 - Usos Esta alga como recurso biológico es de suma importancia debido a la extracción de alginatos, así como también en la industria alimentaria, textil, cosmética y farmacéutica. Asimismo, cumple con un rol ecológico ya que su función principal es la de protección brindado un lugar seguro a invertebrados marinos y peces ante la presencia de otros depredadores.22 19 - Estudios terapéuticos Un estudio realizado demostró la actividad antidiabética del extracto etanólico de Lessonia nigrescens (LNE) en ratones diabéticos tipo 2 inducidos por estreptozotocina (SZT). Sus niveles de glucosa en sangre en ayunas disminuyeron significativamente después de la administración de LNE, demostrando que podría proteger la arquitectura celular del hígado y el riñón. El tratamiento con LNE aumenta significativamente las poblaciones de Bacteroidetes y disminuye las Firmicutes en la microflora intestinal. Se podría considerar a LNE como un alimento funcional para reducir la glucosa en sangre y regular la microflora intestinal.9 1.6.3. Meloidogyne spp Es un nematodo fitoparásito, microscópico y polífago capaz de parasitar más de 2000 especies de plantas, tiene una amplia distribución debido a que no existe suelo con cultivos infestados de estos parásitos. Su erradicación viene a ser difícil ya que al adaptarse rápidamente a las condiciones climáticas se establecen permanentemente en los suelos. Se encuentra en el grupo de los endoparásitos sedentarios y se le caracteriza por presentar un estilete poco robusto en la cual ingresan a los tejidos de las plantas tornándose inmóviles para producir una proliferación celular mediante su alta actividad enzimática generando la formación de nódulos y heridas en la raíz del hospedero.2 - Características morfológicas Este género de Meloidogyne presenta las siguientes dimensiones: la hembra mide 700 µ de largo y 400 µ de diámetro, el macho 1 400 µ de largo y 30 µ de diámetro, el juvenil dos (J2) 400 µ de largo y 15 µ de diámetro y un huevo 95 µ de largo y 40 µ de diámetro. Las formas de las hembras son diferentes, mayormente ensanchadas y toman formas diferentes que se conocen como dimorfismo sexual, en cuanto a los machos se mantienen en su mismo forma: delgados y cilíndricos. Su ciclo de vida en muy breve alcanzando los 25 días a una temperatura de 27° en plantas de vid. En casos que hubiera condiciones desfavorables como la falta de alimentos (diapausa), puede cambiar de sexo de hembra a macho debido a que en este estado no se alimenta.2 20 1.6.4. Extractos vegetales: Son caracterizados por tener metabolitos secundarios que cumplen la función defensiva de las plantas o algas tales como compuestos nitrogenados, fenólicos, terpenoides que presentan diversas funciones para la utilización en las áreas de la salud, agrícola e industrial principalmente.24 Son obtenidos por el uso de un solvente (alcohol, agua, mezcla de estos u otro solvente selectivo) y un proceso de extracción adecuado, el uso del solvente y de la técnica de extracción, podremos obtener una diferente gama de sustancias.25 - Metabolitos secundarios: Son compuestos bioactivos de bajo peso molecular que se sintetizan y acumulan en respuesta a la defensa química contra el daño que ocasionan las heridas y el ataque de microorganismos patógenos. Su síntesis deriva del metabolismo primario dependiendo también de la etapa de desarrollo de la planta y sus niveles constitutivos solo se incrementan como parte de la respuesta al estrés abiótico o biótico; éste aumento es importante para la supervivencia de las plantas. Es notable mencionar que tanto su biosíntesis y almacenamiento ocurren en diferentes lugares de la célula vegetal.4 - Métodos de extracción: En la actualidad el aislamiento de los principios activos está vinculado a ensayos farmacológicos, no solo con el fin de su uso terapéuticos sino también para el análisis y estudio de una nueva sustancia activa.26  Extracción Discontinua27 Este método sumerge la droga en el solvente en su totalidad, produciéndose la extracción y difusión de los principios activos en todas las direcciones alcanzando el equilibrio. Presenta diversos métodos variando su temperatura, tiempo y solventes utilizados.  Maceración: Indicada para la extracción de principios activos a temperatura ambiente, utilizando como solventes principales el agua o mezclas hidroalcohólicas, 21 asimismo el tiempo empleado oscila entre horas a días, debiendo mantener en constante agitación y en un ambiente oscuro.  Extracción Continua Este método pone en contacto la droga con el solvente adecuado en todo momento mantenimiento el desequilibrio entre los metabolitos secundarios de la droga y en el solvente lo cual permite que se produzca la difusión celular. Los principales métodos de extracción continua son: Percolación y Soxhlet.27  Soxhlet Es un proceso de extracción sólido-líquido. La temperatura que se utiliza es alta conllevando a ser un principal inconveniente, sin embargo, facilita la solubilización de las sustancias usando principalmente disolventes de punto de ebullición bajo, ejemplo: diclorometano, metanol o hexano. La extracción se realiza en un aparato que consta de tres partes: matraz de fondo plano, un cuerpo extractor y un refrigerante. En el cuerpo del extractor se coloca el disolvente orgánico a utilizar que se llevará a ebullición y los vapores ascienden por el tubo lateral y llegan al refrigerante en donde se condensan y caen sobre la droga situada en el cuerpo del extractor, cuando este se llena de líquido extractivo, se vacía por el sifón lateral interno y desemboca en el matraz inferior. El disolvente se va reciclando durante el proceso mientras que los principios activos se concentran en el matraz inferior. 26 Culminada la extracción es necesario esperar un determinado tiempo hasta que el sistema se enfríe en su totalidad para poder manipularlo. 28 1.6.5. Cromatografía de capa fina (CCF)29 Es una técnica analítica en la que consiste en la separación de los componentes de una mezcla en donde la fase estacionaria puede migrar sobre un soporte plano, visualizando los componentes mediante reveladores físicos tales como la lámpara con emisión de luz UV y reveladores químicos como son las sustancias químicas con reactividad. 22 II. ESTRATEGIA METODOLÓGICA 2.1. Tipo y diseño de la investigación: 2.1.1. Tipo de investigación: Aplicada Se caracteriza por dar solución a un determinado problema o planteamiento específico, en donde se enfoca en la búsqueda y consolidación del conocimiento para su posterior aplicación fortaleciendo el desarrollo cultural y científico. 2.1.2. Diseño de investigación: Diseño experimental: es aquella donde el investigador manipula una variable y control o aleatoriza el resto de variables. 2.2. Lugar de investigación: El presente trabajo de investigación se realizó en la región Ica, Departamento Ica, Distrito Ica, Av, Los Maestros s/n Ciudad Universitaria, durante los meses de enero 2023 y mayo del 2023 y los ensayos se ejecutaron en el Instituto de Investigación y el laboratorio de Química Farmacéutica de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional San Luis Gonzaga. 2.3. Materiales y Métodos 2.3.1. Materiales de laboratorio - Probetas - Tubos de ensayo - Gradillas - Embudos - Baguetas - Pipetas volumétricas (5 ml) - Pipetas Pasteur - Pipetas capilares - Placas Petri de plástico 5cm de diámetro 0,4 de alto - Pizetas - Tamiz de acero inoxidable 25 micras de diámetro - Placas de reacción de porcelana 23 2.3.2. Material biológico - Hojas y talos de Lessonia nigrescens Bory de Sant-Vicent “aracanto negro” - Semillas de tomate variedad “Río grande” - Raíces de plantas de tomate infestadas con el nematodo Melodoigyne spp. - Tierra infestada con el nematodo Meloidogyne spp. 2.3.3. Equipos - Balanza analítica - Microscopio con cámara integrada MODELO: PRIMOSTAR HD Marca: ZEISS - Equipo Soxhlet. - Evaporador rotatorio marca HEIDOLPH modelo LABOROTAA 4000. - Estufa 2.3.4. Reactivos - Agua destilada - Etanol 96° - Diclorometano - Anhidrido acético - Hidróxido de amonio - Sulfato de sodio anhidro - Cloruro de sodio - Cloruro Férrico - Reactivo de Ninhidrina - Solución de metionina - Ácido clorhídrico concentrado - Limaduras de magnesio. - Anhídrido acético - Ácido sulfúrico. - Hidróxido de sodio. - Metanol - Hidróxido de potasio - Reactivo de Dragendorff - Reactivo de Mayer - Alcohol amílico - Cloroformo 24 2.3.5. Otros - Papel de filtro - Papel de aluminio - Papel toalla - Tubos PVC - Malla 50 cm - Lejía - Barra de silicona - Envases pequeños de plástico - Pistola de silicona - Tapers de plástico grande - Macetas pequeñas - Licuadora - Regla - Aguja - Plumón indeleble 2.4. Población - Nemátodos de Meloidogyne spp en dos estadíos (huevos y Juveniles 2). 2.5. Muestra - Muestra botánica de Hojas y Talos de la especie marina Lessonia nigrescens - Cantidad de semillas de Solanum lycopersicum (tomate) de la especie “Río Grande”. 2.6. Metodología 2.6.1. Recolección y preparación de las muestras: - Recolección: Para la elaboración del presente estudio, las algas de Lessonia nigrescens fueron recolectadas en la Bahía de Paracas ubicada en la provincia de Pisco (Enero del 2023) Fueron lavadas con agua de mar para remover el exceso de arena, epífitos y sal. Posteriormente transportadas en bolsas herméticas hasta la ciudad de Ica. Una parte de lo recolectado fue enviado al laboratorio de Biología de la Universidad Nacional San Luis Gonzaga para su clasificación taxonómica. (Anexo N° 1). El resto de la 25 muestra fresca fue llevada al Instituto de Investigación para la ejecución del presente estudio. - Tratamiento de la Muestra Vegetal: El alga fue lavada manualmente con agua destilada para poder eliminar cualquier residuo que haya quedado del mar, repitiendo este proceso hasta drenar el exceso de agua. Las algas se colocaron en un ambiente seco y ventilado, sin luz directa al sol para que se sequen de manera natural durante 15 días. Pasado este tiempo se cortaron en pequeños trozos de 2 cm y se almacenaron en bolsas de papel kraft, separando las hojas y los talos. (Anexo N° 2) - Obtención de extractos. Para obtener el extracto se utilizó 1 Kg de las muestras secas y molidas macerándolos durante 15 días con 4 litros de etanol de 96° y renovando el solvente cada 7 días. Culminado el tiempo se pasó a filtrar, seguidamente el marco de ambos macerados (hojas y talos) fueron llevados a extracción por el método de Soxhlet con etanol de 96° hasta llegar al agotamiento de la muestra. - Los filtrados obtenidos se concentraron a presión reducida utilizando un evaporador rotatorio. (Anexo N° 3) 2.6.2. Identificación de metabolitos secundarios en los extractos etanólicos de Lessonia nigrescens (arcanto) Para la realización de este procedimiento se utilizó los extractos etanólicos de hojas y talos de Lessonia nigrescens con el fin de identificar los metabolitos secundarios presentes en el alga. - Identificación de Flavonoides  Reacción de Shinoda: en una placa de reacción de porcelana se colocaron 3 gotas de cada extracto etanólico, posteriormente de agrega 5 limaduras de Mg y 5 gotas de HCl, dejando reposar por unos segundos. 26 - Identificación de Aminoácidos  Reacción Ninhidrina: en tiras de papel de filtro se colocaron con ayuda de una pipeta capilar una gota de cada extracto etanólico y una gota del reactivo de Ninhidrina al 2%, dejándose a secar a temperatura ambiente y posterior a eso se colocaron en la estufa a 120°C. - Identificación de Grupos fenólicos  Reacción de Cloruro Férrico: en una placa de reacción se colocaron 5 gotas de los extractos etanólicos agregándose 3 gotas de solución acuosa de FeCl3, dejándose reposar por unos segundos. - Identificación de Taninos:  Reacción de Gelatina-sal: se colocaron en 4 tubos de ensayo los extractos etanólicos (1mL) en donde se agregaron 1 mL de agua, se agita y se filtra, posteriormente se agrega 1 ml de solución de gelatina-sal y por último se verifica el precipitado. - Identificación de Triterpenos y/o Esteroides  En cada muestra se agregó 1 ml de diclorometano, llevándose a baño maría y procedimos a filtrar.  Se procedió colocarse todas las muestras y se agregaron 5 gotas de anhídrido acético y 5 gotas de ácido sulfúrico, dejándose reposar por unos segundos. - Identificación de Alcaloides  En cada muestra se agregó 1 ml de HCl, llevándose a baño maría y procedimos a filtrar.  Los 4 tubos que contienen los extractos con HCl se dividen en dos tubos más colocando en cada tubo 3 gotas de Reactivo de Mayer y 3 gotas de Reactivo Dragendorff respectivamente y por último se verifica el precipitado. - Identificación de Leucoantocianidinas y catequinas:  Reacción de Rosenheim: se colocó en 4 tubos las muestras con 1 ml de etanol en cada uno, luego se le agregó 0,5 ml de HCl concentrado, posterior a ello se 27 llevó a baño maría por 10 min a 100 °C, se deja enfriar y se le añadieron 3 ml de agua destilada, por último, se le añadió 3 ml de alcohol amílico y agitamos. - Identificación de Antraquinonas  Reacción de Bornträger: colocar en 4 tubos de ensayo las muestras y agregamos 2 mL de diclorometano y luego se añadió 4 mL de NaOH 5%, agitándose suavemente. - Identificación de Cardenólidos  Reacción de Kedde: colocar en 4 tubos de ensayo las muestras y agregamos 1 ml de metanol a cada uno. Asimismo, se prepara en otro tubo una mezcla de 2 ml de hidróxido de potasio al 5.7% y 2 ml de ácido 3,5- dinitrobenzoico al 2%. Por último, se agrega 5 gotas de esta mezcla a cada tubo. - Identificación de Saponinas  Prueba de espuma: Se pesa 1g de muestra (hojas y talos) y se agregó 20 ml de agua destilada, se puso a hervir durante 15 min y se filtró en caliente, enrasamos a 20 ml con agua destilada y dejamos enfriar. Medimos 2,5 ml del preparado y se colocó en un tubo agitándose por 1 min, por último, se dejó reposar 15 min y se mide la espuma. - Cromatografía Se realizó la mezcla entre una pequeña muestra (4 muestras) con 1 ml de etanol y haciendo uso del tubo capilar se deposita en las tiras de papel cromatográfico para llevarlo a sumergir en 2 ml de éter de petróleo en un vaso de precipitado y se tapó con papel aluminio. Cuando se secó se llevó a la lámpara ultravioleta (254 / 360). Así se realizó el mismo procedimiento cambiando el solvente en donde se sumerge la muestra (diclorometano y acetato de etilo) Por último, se realizó una mezcla de 10 ml de éter de petróleo y acetato de etilo (6:4) y se colocó la tira con las muestras sembradas. 28 2.6.3. Ensayos In Vitro - Obtención de Meloidogyne spp. (J2) (Anexo N° 4) Los nematodos en estadío Juveniles (J2) que se necesitan para realizar los ensayos se obtuvieron a partir de la tierra adyacente a raíces de tomates y pallares que presentaron nódulos, característica principal de la infestación de Meloidogyne spp. Para realizar el aislamiento del nematodo M. spp, se utilizó el método de la bandejita (método del embudo de Baermann Modificado)2. Esta bandejita fue confeccionada mediante un tamiz a partir de un tubo de PVC (6 cm de alto y 6 pulgadas de diámetro) y malla de plástico (1 mm de trama), en donde se colocó una capa de papel toalla y sobre esta se depositó 50 cc de suelo de los campos infestados con Melodoigyne spp, seguidamente se depositó el anillo de PVC con la malla en un taper de plástico sin que el anillo de PVC haga contacto con el fondo. Posterior a ello se agregó agua de caño limpia con la pizeta por el espacio comprendido entre el anillo de PVC y el taper de plástico hasta que el agua llegue a la muestra de suelos por filtración. La cantidad de agua que se ha agregado fue hasta que se observe la muestra de suelo completamente húmeda (50 ml aproximadamente). Estas bandejas fueron cubiertas con una tapa para darles condiciones de oscuridad y evitar que caigan partículas extrañas del exterior. Pasando las 48 horas, se retiró la malla que contiene el suelo y el agua que ha sobrado en el fondo del taper fue recolectado en una placa Petri con ayuda de una pipeta. Después del traspaso de los nematodos, fueron identificados por observación directa con el uso de un microscopio con cámara integrada a escala de 40X. Este método se basa en la capacidad de la movilidad de los nematodos en el agua para atravesar los filtros del papel toalla y la malla de plástico, siendo un indicador de su viabilidad. - Prueba de mortandad de Meloidogyne spp (J2) (Anexo N° 5)  Determinación de la efectividad de las hojas y talos de Lessonia nigrescens En una gradilla se colocaron 10 tubos de ensayo estériles que contenían los extractos de hojas y talos de Lessonia nigrescens a las concentraciones de 1, 50 y 100 % usando agua potable como vehículo y un testigo (agua potable), en 29 donde se transfirieron con la pipeta Pasteur aproximadamente 100 individuos de Meloidogyne spp en estadío J2 con la ayuda del microscopio con cámara integrada a escala de 40X, permaneciendo por un espacio de 24 h. Pasado este tiempo se transfirieron a otro tubo de ensayo estériles conteniendo agua potable dejándose por un tiempo de 24 horas más; al término de este tiempo se realizó el primer conteo de los individuos muertos y después de 24 horas más se realizó un conteo definitivo para verificar los resultados.  Ensayos con el extracto etanólico más efectivo El extracto etanólico disuelto en agua, se ensayó a diferentes concentraciones (0.1, 1, 10, 50, 100%), siendo el testigo agua potable. Se procedió con el mismo procedimiento descrito en el punto anterior. - Concentración letal media (CL 50)30 Para la concentración letal media, se utilizó el extracto etanólico que presentó mayor efecto nematicida a diferentes concentraciones (100, 50, 10 y 5 mg/mL) en la cual estuvo en contacto por 72 horas los J2. Pasado este tiempo se procedió a contar los individuos muertos de cada tubo. Este procedimiento se realizó por triplicado. Los datos se procesaron haciendo uso del método Probit descrito por FINNEY, dando como resultado el valor de CL 50, es decir, la concentración en la que se produce la muerte del 50% de la población de la Meloidogyne spp, teniendo un intervalo de confianza de 95%. - Prueba estadística31 Los datos fueron analizados haciendo uso de los procedimientos de análisis de varianza y comparación de medias (LSD, P<0.05). 2.6.4. Prueba de Bioensayo en las plantas de tomate - Tratamientos en estudio y diseño experimental Para el presente ensayo se ha empleado como tratamientos los extractos etanólicos de las hojas y los talos del alga Lessonia nigrescens a concentraciones determinadas por los resultados obtenidos del ensayo in vitro, en los que fueron comparados con 30 cuatro testigos: testigo químico “Vydate® L”, testigo orgánico “Nema 100”, testigo inoculado y un testigo control sin inoculación. (Tabla 2). Se ha realizado este trabajo teniendo tres momentos de aplicación utilizando el diseño aleatorizado, en macetas, teniendo como sistema de riego la regadera para evitar una contaminación cruzada entre los tratamientos. 31 Tabla 2. Tratamientos usados para el control del nemátodo Meloidogyne spp en plantas de tomate. Tratamiento Descripción Dosis Código 1° aplicación 2° aplicación 3° aplicación T1 Extracto etanólico de las hojas de L. nigrescens 1% * EEHLN 1% 7 días después de la inoculación 7 días después de la 1° aplicación 15 días después de la 1° aplicación T2 Extracto etanólico de las hojas de L. nigrescens 10% * EEHLN 10% 7 días después de la inoculación 7 días después de la 1° aplicación 15 días después de la 1° aplicación T3 Extracto etanólico de las hojas de L. nigrescens 50% * EEHLN 50% 7 días después de la inoculación 7 días después de la 1° aplicación 15 días después de la 1° aplicación T4 Extracto etanólico de los talos de L. nigrescens 1% * EETLN 1% 7 días después de la inoculación 7 días después de la 1° aplicación 15 días después de la 1° aplicación T5 Extracto etanólico de los talos de L. nigrescens 10% * EETLN 10% 7 días después de la inoculación 7 días después de la 1° aplicación 15 días después de la 1° aplicación T6 Extracto etanólico de los talos de L. nigrescens 50% * EETLN 50% 7 días después de la inoculación 7 días después de la 1° aplicación 15 días después de la 1° aplicación T7 Vydate ® L (Oxamyl) 4 L/ Ha TQ 7 días después de la inoculación 7 días después de la 1° aplicación 15 días después de la 1° aplicación T8 Nema 100 (Mezcla orgánica) 3 L / Ha TO 7 días después de la inoculación 7 días después de la 1° aplicación 15 días después de la 1° aplicación T9 Testigo inoculado - TI - - - T10 Testigo control - TC - - - * Dosis establecidas después de obtener los resultados en los ensayos in vitro 32 - Preparación de los almácigos Los almácigos fueron preparados haciendo uso de las semillas de tomate de la especie “Río Grande”, siendo estas muy comerciales y susceptibles a la infestación del nemátodo Meloidogyne spp; en la cual se utilizaron bandejas de siembra de 50 cm largo x 30 cm de ancho y arena fina, realizando 3 surcos en la misma en donde se colocaron 100 semillas aproximadamente. Las semillas germinaron en el día 7 del sembrado y para el día 20 fueron trasplantadas a macetas individuales. - Trasplante de plantines a las macetas Una vez pasado los 20 días en el almácigo, los plantines fueron trasplantados en macetas de 1 Kg de capacidad desinfectadas previamente con hipoclorito de sodio al 5 %, siendo posteriormente llenadas con sustrato estéril a concentraciones siguientes: 2 de suelo / 1 arena / 1 compost. - Inoculación con huevos de Meloidgyne spp a macetas2 Hussey y Barker (1973) establecieron el método del hipoclorito de sodio al 0,5% para la extracción de huevos en raíces infestadas con Meloidogyne spp31. Esta técnica fue realizada haciendo uso de raíces infestadas con el nematodo agallador y cortándose en trozos de 1 cm, depositando 5 g de los mismos a una licuadora y vertiendo 100 ml una solución de hipoclorito de sodio al 0,5% preparado previamente, procediendo a licuarlo en 3 tiempos de 10 segundos cada uno. Posteriormente el contenido obtenido se trasvasó a un vaso de precipitado, y seguidamente de pasó por tres tamices de 500, 180 y 38 µm siendo estos colocados uno encima del otro de mayor a menor por el tamaño de los poros, haciendo un lavado con agua corriente de manera suave para así obtener todo el residuo del tamiz más fino en otro vaso de precipitado y fue enrasado a 100 ml con agua potable homogenizándolo con una bagueta. De la muestra obtenida se tomó una alicuota de 1 ml que se depositó en una placa Petri de plástico (se realizó 10 trazos con plumón indeleble para separar los campos y que facilite el recuento de huevos) y se observó en el microscopio con 40X de aumento (Ver Anexo N° 6). Este procedimiento se realizó por triplicado para obtener el promedio del resultado de la cantidad de huevos por ml. 33 Pasados 10 días del trasplante de las plantas de tomate, fueron inoculadas con 1000 huevos por maceta, en donde se abrieron surcos de 5 cm de profundidad. - Evaluación N°1 de la población de Meloidogyne spp y primera aplicación de los tratamientos31 Para esta primera evaluación del suelo tuvieron que pasar 7 días de la inoculación realizada, tomando una muestra representativa de 100 cc de suelo a una profundidad de 10 cm por cada maceta. Estas muestras fueron recolectadas en bolsas impermeables y se analizaron mediante el método de la bandejita (previamente descrita) en donde se obtuvo una población de nematodos en estadío Juveniles 2 (J2). Después del análisis se procedió a humedecer el suelo para realizar la aplicación de los tratamientos sobres las macetas, realizando surcos de 3 cm de profundidad y se finalizó nuevamente con un regado de favorecer la difusión de la aplicación dejando actuar por 7 días. - Trasplante y segunda aplicación de los tratamientos31 A raíz que las plantas están crecimiento se procedió a hacer un trasplante a macetas de 2 Kg de capacidad con sustrato estéril (2 suelo/1 arena/ 1 compost) posterior a los 7 días de la primera aplicación de los tratamientos. Seguidamente se realizó la segunda aplicación de los tratamientos y se dejó actuar por 7 días más. - Evaluación N° 2 de la población y tercera aplicación de los tratamientos31 Pasados los 7 días después de la segunda aplicación de los tratamientos se procedió con la evaluación de la población de nematodos en el suelo, haciendo uso del mismo método utilizado para la primera evaluación de los nematodos. Después de realizar el análisis se procedió a realizar la tercera aplicación de los tratamientos. - Evaluación N° 3 de la población de Meloidogyne spp31 Esta última evaluación fue realizada pasados 7 días de la tercera aplicación de los tratamientos, en la que se determinó la población final de nematodos por 100 cc haciendo uso del método utilizado en las evaluaciones anteriores. (Anexo N° 7) 34 - Toma de datos biométricos31 Para este procedimiento las plantas fueron retiradas del suelo y lavadas meticulosamente con agua corriente para eliminar cualquier residuo de tierra, el cual sus raíces fueron rotuladas, pesadas y medidas junto con el follaje fresco para su última evaluación. - Diseño estadístico en condición semicontrolada Para esta condición semicontrolada se utilizó el diseño completo al azar (DCA), realizando la evaluación a tres repeticiones por tratamiento. Los datos obtenidos fueron llevados a analizar haciendo uso el procedimiento de Análisis de varianza y comparación de medias (LSD, P<0,05). 35 III. RESULTADOS El presente trabajo tuvo como objetivo evaluar el efecto nematicida de Lessonia nigrescens (Arcanto) frente al nematodo agallador Meloidogyne spp que fueron obtenidas de suelos y raíces de plantas de tomate infestadas del valle de Ica. La efectividad de los diferentes extractos y concentraciones de los mismos están determinado por la mortandad que se ha ocasionado en los nematodos, expresada en porcentaje. 3.1. Características organolépticas de los extractos etanólicos de Lessonia nigrescens (Arcanto) El extracto etanólico de las hojas de Lessonia nigrescens (arcanto) presenta un color verde oscuro, muy viscoso y olor característico. El extracto etanólico de los talos de Lessonia nigrescens (arcanto) presenta un color marrón oscuro, de aspecto viscoso y olor característico. 3.2. Identificación de metabolitos secundarios en los extractos etanólicos de Lessonia nigrescens (Arcanto) Obtenido los extractos etanólicos se realizaron la identificación de los metabolitos secundarios obteniendo los siguientes resultados: 3.2.1. Identificación de Flavonoides (Reacción de Shinoda) Para la identificación de flavonoides y que la reacción sea positiva debe aparecer tonos de color rojo, anaranjado y violeta, en donde se observó lo siguiente: - Macerado de Hojas: Negativo. - Extracción de Soxhlet de Hojas: Positivo. - Macerado de Talos: Positivo. - Extracción de Soxhlet de Talos: Positivo. 36 Figura 3. Identificación de flavonoides en los extractos etanólicos de Lessonia nigrescens. 3.2.2. Identificación de Aminoácidos (Reacción de Ninhidrina) Para la identificación de aminoácidos y que la reacción sea positiva debe apreciarse un color azul violáceo, en donde se observó lo siguiente: - Macerado de Hojas: Positivo - Extracción de Soxhlet de Hojas: Positivo. - Macerado de Talos: Positivo. - Extracción de Soxhlet de Talos: Positivo. Figura 4. Identificación de Aminoácidos en los extractos etanólicos de Lessonia nigrescens. TALOS Soxhlet Macerado (+) (+) HOJAS Macerado Soxhlet (-) (+) MACERADO Talos Hojas (+) (+) E. SOXHLET Talos Hojas (+) (+) 37 3.2.3. Identificación de Grupos fenólicos libres (Reacción de Cloruro Férrico) Para la identificación de grupos fenólicos libres y que la reacción sea positiva debe apreciarse un color azul-negro, verde o azul verdoso, en donde se observó lo siguiente: - Macerado de Hojas: Positivo - Extracción de Soxhlet de Hojas: Positivo. - Macerado de Talos: Negativo. - Extracción de Soxhlet de Talos: Positivo. Figura 5. Identificación de Grupos fenólicos libres en los extractos etanólicos de Lessonia nigrescens. 3.2.4. Identificación de Taninos (Reacción de Gelatina-sal) Para la identificación de taninos y que la reacción sea positiva debe apreciarse un precipitado, en donde se observó lo siguiente: - Macerado de Hojas: Negativo. - Extracción de Soxhlet de Hojas: Negativo. - Macerado de Talos: Negativo. - Extracción de Soxhlet de Talos: Negativo. HOJAS Macerado Soxhlet (+) (+) TALOS Macerado Soxhlet (-) (+) 38 Figura 6. Identificación de taninos en los extractos etanólicos de Lessonia nigrescens. 3.2.5. Identificación de Triterpenos y/o Esteroides (Reacción de Liebermann Burchard) Para la identificación de triterpenos y/o esteroides y que la reacción sea positiva debe apreciarse un color verde, azul verdoso (vías rojo o azul), en donde se observó lo siguiente: - Macerado de Hojas: Positivo. - Extracción de Soxhlet de Hojas: Positivo. - Macerado de Talos: Positivo. - Extracción de Soxhlet de Talos: Positivo. Figura 7. Identificación de triterpenos y/o esteroides en los extractos etanólicos de Lessonia nigrescens. Negativo Macerado Hojas (+) Soxhlet Hojas (+) Macerado Talos (+) Soxhlet Talos (+) 39 3.2.6. Identificación de Alcaloides Para la identificación de alcaloides y que la reacción sea positiva debe apreciarse un precipitado, en donde se observó lo siguiente: - Macerado de Hojas: Negativo. (Mayer y Drangendorff) - Extracción de Soxhlet de Hojas: Negativo. (Mayer y Drangendorff) - Macerado de Talos: Negativo. (Mayer y Drangendorff) - Extracción de Soxhlet de Talos: Negativo. (Mayer y Drangendorff) Figura 8. Identificación de alcaloides en los extractos etanólicos de Lessonia nigrescens. 3.2.7. Identificación de Leucoantocianidinas y Catequinas (Reacción de Rosenheim) Para la identificación de leucoantocianidinas y catequinas y que la reacción sea positiva debe apreciarse un color que va desde el rosado débil hasta carmesí oscuro, en donde se observó lo siguiente: - Macerado de Hojas: Negativo (Leucoantocianidinas y catequinas). - Extracción de Soxhlet de Hojas: Negativo (Leucoantocianidinas y catequinas). - Macerado de Talos: Positivo. (Catequinas). - Extracción de Soxhlet de Talos: Positivo. (Catequinas). M. Hojas (-) S. Hojas (-) M. Talos (-) S. Talos (-) 40 Figura 9. Identificación de leucoantocianidinas y catequinas en los extractos etanólicos de Lessonia nigrescens. 3.2.8. Identificación de Antraquinonas (Reacción de Bornträger) Para la identificación de antraquinonas y que la reacción sea positiva debe apreciarse que la fase acuosa sea de un color rojo, en donde se observó lo siguiente: - Macerado de Hojas: Negativo. - Extracción de Soxhlet de Hojas: Negativo. - Macerado de Talos: Positivo. - Extracción de Soxhlet de Talos: Positivo. Figura 10. Identificación de antraquinonas en los extractos etanólicos de Lessonia nigrescens. Hojas (-) Talos (+) Hojas (-) Talos (+) 41 3.2.9. Identificación de Cardenólicos (Reacción de Kedde) Para la identificación de cardenólicos y que la reacción sea positiva debe apreciarse que la fase acuosa sea de un color púrpura o violáceo, en donde se observó lo siguiente: - Macerado de Hojas: Negativo. - Extracción de Soxhlet de Hojas: Negativo. - Macerado de Talos: Negativo. - Extracción de Soxhlet de Talos: Negativo. Figura 11. Identificación de cardenólicos en los extractos etanólicos de Lessonia nigrescens. 3.2.10. Identificación de Saponinas (Prueba de Espuma) Para la identificación de saponinas y que la reacción sea positiva debe apreciarse que se forme una espuma con una altura mayor de 5 mm, en donde se observó lo siguiente: - Muestra de Hojas: Positivo. - Muestra de Talos: Negativo. Hojas (-) Talos (-) 42 Figura 12. Identificación de saponinas en las muestras de Lessonia nigrescens. 3.2.11. Cromatografía Se utilizó como fase móvil la mezcla compuesta por éter de petróleo y acetato de etilo (6:4), solventes poco polar y muy polar respectivamente; en la cual se identificaron más metabolitos secundarios en el extracto de hojas (macerado y por extracción de Soxhlet). Figura 13. Identificación de principales familias de metabolitos secundarios en los extractos de Lessonia nigrescens. Hojas (+) Talos (-) 43 3.3. Ensayos in vitro 3.3.1. Determinación de los extractos de Lessonia nigrescens con mayor efecto (hojas y talos) Los extractos del alga Lessonia nigrescens de hojas y talos a concentraciones 1, 50 y 100 % presentaron efecto nematicida sobre Meloidogyne spp a comparación al testigo (P>0,05). En ambos extractos (hojas y talos) a concentración del 100% produjeron el 100% de mortandad en los nematodos J2; sin embargo, a concentraciones de 50% se obtuvo una mortandad de 70.2% para el extracto de talos y 96.4% para el extracto de hojas. Por último, para una concentración del 1% se obtuvo una mortandad de 34% Y 55% respectivamente; demostrándose que el extracto de hojas de Lessonia nigrescens tiene mayor efecto nematicida. (Fig. 14) Figura 14. Porcentajes de mortandad in vitro de Meloidogyne spp por el efecto nematicida de los extractos de Lessonia nigrescens (hojas y talos) 3.3.2. Ensayos con el extracto de hojas de Lessonia nigrescens a diferentes concentraciones La mortandad (expresada en %) producida por el extracto etanólico a diferentes concentraciones se describen en la Tabla 3. A una concentración del 50% se observó un mayor efecto (96.4%). La concentración con mayor efecto nematicida es de 100%, sin embargo, se obtiene efecto significativo con 50% del extracto. 44 Tabla 3. Porcentajes de mortandad de Meloidogyne spp producida por el extracto etanólico de las hojas de Lessonia nigrescens a diferentes concentraciones. Concentración (%) Extracto Etanólico 0.1 23.3 1 55 10 76 50 96.4 100 100.0 Testigo 2.1 Para la concentración letal media para el extracto etanólico de las hojas de Lessonia nigrescens fue 0.882 mg/mL (Tabla 4). Tabla 4. Concentración Letal Media del extracto etanólico de las hojas de Lessonia nigrescens en el ensayo in vitro. Extracto Concentración (mg/mL) Porcentaje de mortandad (%) Logaritmo de la concentración Concentración Letal Media (mg/mL) Etanólico 100 100 2 0.882580908 50 91 1.698970004 10 78 1 5 67 0.698970004 45 Figura 15. Porcentajes de mortandad de Meloidogyne spp producida por el extracto etanólico de las hojas de Lessonia nigrescens a diferentes concentraciones 3.4. Prueba de Bioensayo en plantas de tomate 3.4.1. Determinación del extracto etanólico con mayor efectividad Los extractos etanólicos de las hojas y los talos del alga Lessonia nigrescens a concentraciones de 1, 10, 50 % presentaron un mayor efecto nematicida sobre el nematodo Meloidogyne spp en comparación al testigo inoculado. En primer lugar, se tiene el extracto etanólico de las hojas al 50% con un efecto nematicida constante. (Tabla 5, Figuras 16 y 17) 46 Tabla 5. Efectos biométricos sobre plantas de tomate de los extractos etanólicos de las hojas y talos de Lessonia nigrescens a diferentes concentraciones, tratamiento químico, orgánico, inoculado en comparación con el testigo control. Tratamiento Peso de raíces Longitud de raíces Peso de follaje fresco Longitud de follaje fresco (g) (cm) (g) (cm) T1 EEHLN 1% 6,5 20,2 12,6 37,5 T2 EEHLN 10% 7,2 25,1 13,9 42,1 T3 EEHLN 50% 8,0 26,4 15,0 48,4 T4 EETLN 1% 6,0 18,3 10,7 35,6 T5 EETLN 10% 6,2 21,5 11,3 38,4 T6 EETLN 50% 7,2 24,2 14,2 40,2 T7 Testigo químico 7,0 25,6 13,1 34,5 T8 Testigo orgánico 8,5 15,9 14,8 46,6 T9 Testigo inoculado 3,9 9,8 5,2 31,2 T10 Testigo control 4,5 12,9 7,0 33,4 *EEHLN: Extracto Etanólico de las hojas de Lessonia nigrescens. *EETLN: Extracto Etanólico de los talos de Lessonia nigrescens. 47 *EEHTLS: Extracto etanólico de hojas de Lessonia nigrescens, *EETLS: Extracto etanólico de talos de Lessonia nigrescens, *T. qco: Testigo químico, *T. org: Testigo orgánico, *T. inoc: Testigo inoculado, *T.ctrl: Testigo control. Figura 16. Porcentaje de mortandad del bioensayo en plantas de tomate de Meloidogyne spp producida por los extractos etanólicos de hojas y talos del alga Lessonia nigrescens a diferentes concentraciones. Figura 17. Número de individuos J2 de Meloidogyne spp / 100 cc de suelo en las 3 evaluaciones del tratamiento con mayor efectividad nematicida en comparación con el testigo químico, orgánico e inoculado. 48 Tabla 6. Concentración Letal Media del extracto etanólico de las hojas de Lessonia nigrescens en el bionsayo en plantas de tomate. Extracto Concentración (mg/mL) Porcentaje de mortandad (%) Logaritmo de la concentración Concentración Letal Media (mg/mL) Etanólico 100 94 2 0.806360234 50 88 1.698970004 10 73 1 3.4.2. Determinación del efecto potenciador de crecimiento de las plantas del tomate *EEHTLS: Extracto etanólico de hojas de Lessonia nigrescens, *EETLS: Extracto etanólico de talos de Lessonia nigrescens, *T. qco: Testigo químico, *T. org: Testigo orgánico, *T. inoc: Testigo inoculado, *T.ctrl: Testigo control. Figura 18. Resultados del peso de las raíces de tomate (g) que fueron evaluados al finalizar el tratamiento con los extractos etanólicos de Lessonia nigrescens (hojas y talos) en diferentes concentraciones testigo químico y testigo orgánico. 49 *EEHTLS: Extracto etanólico de hojas de Lessonia nigrescens, *EETLS: Extracto etanólico de talos de Lessonia nigrescens, *T. qco: Testigo químico, *T. org: Testigo orgánico, *T. inoc: Testigo inoculado, *T.ctrl: Testigo control Figura 19. Resultados de la longitud de las raíces de tomate que fueron evaluados al finalizar el tratamiento con los extractos etanólicos de Lessonia nigrescens (hojas y talos) en diferentes concentraciones testigo químico y testigo orgánico. *EEHTLS: Extracto etanólico de hojas de Lessonia nigrescens, *EETLS: Extracto etanólico de talos de Lessonia nigrescens, *T. qco: Testigo químico, *T. org: Testigo orgánico, *T. inoc: Testigo inoculado, *T.ctrl: Testigo control Figura 20. Resultados del peso del follaje fresco de tomates que fueron evaluados al finalizar el tratamiento con los extractos etanólicos de Lessonia nigrescens (hojas y talos) en diferentes concentraciones testigo químico y testigo orgánico. 50 *EEHTLS: Extracto etanólico de hojas de Lessonia nigrescens, *EETLS: Extracto etanólico de talos de Lessonia nigrescens, *T. qco: Testigo químico, *T. org: Testigo orgánico, *T. inoc: Testigo inoculado, *T.ctrl: Testigo control Figura 21. Resultados de la longitud del follaje fresco de tomates que fueron evaluados al finalizar el tratamiento con los extractos etanólicos de Lessonia nigrescens (hojas y talos) en diferentes concentraciones testigo químico y testigo orgánico. 51 IV. DISCUSIÓN La macroalga parda Lessonia nigrescens presenta metabolitos secundarios con acción nematicida tales como saponinas, flavonoides y triterpenos teniendo efecto inhibitorio en la eclosión de los huevos del nematodo Meloidogyne spp33. Por otro lado, también actúan como reguladores de crecimiento de las plantas cuando se encuentran bajo condiciones de estrés produciendo un mayor rendimiento y productividad en los cultivos.34 Los resultados del extracto etanólico del alga Lessonia nigrescens sobre el nematodo Meloidogyne spp han demostrado que presentan actividad nematicida siendo las hojas, parte del alga con mayor efecto, debido a que a baja y mediana concentración (1 y 50 %) produjo una tasa de mortandad mayor al 50% siendo superior al extracto etanólico de talos de L. nigrescens, por otro lado, en los resultados obtenidos en el bioensayo con las plantas de tomate, el extracto de hojas al 50% coinciden con el ensayo anterior, demostrando así que tiene mayor efecto nematicida sin presentar diferencia estadística significativa con los testigos químico y orgánico. Estudios similares efectuados por Mirella Romero-Bastidas et al (2022) en 3 macroalgas, siendo una de ellas un alga parda de la clase Phaeophyceae (Sargassum spp), misma clase perteneciente a L. nigrescens, encontraron que el Sargassum spp a una dosis de 3000 ppm tuvo un mayor efecto nematicida. Asimismo, en el Sargassum spp y Lessonia nigrescens se identificaron los siguientes metabolitos secundarios: terpenos, saponinas y grupos fenólicos; compuestos que están en abundancia y a los que atribuyen diversas actividades biocidas35. Estos resultados son concordantes con los obtenidos en nuestra investigación. Por otro lado, los resultados obtenidos en esta investigación se determinó que las hojas de Lessonia nigrescens (alga parda) presentan un mayor efecto nematicida y un crecimiento foliar considerable en las plantas de tomate, teniendo similitud con los estudios de Diana SS Ibrahim et al (2021), concluyó que los extractos metanólicos de las algas Phacelocarpus tristichus (alga roja) y Turbinaria ornata (alga parda) mejoraron los parámetros de crecimiento y manifestaron actividades nematicidas contra Meloidogyne incognita, siendo el alga parda el que presenta mayor efectividad; así como Galindo Ruth (2011) con las algas Colpemenia sinuosa, Gracilaria lemaneiformis y Ulva papenfussii redujeron los nódulos en las raíces de tomate infestadas, confirmando la propiedad de estas algas marinas (pardas, rojas y verdes) de inhibir el crecimiento de las especies Meloidogyne incognita y Meloidogyne spp. 52 Cabe mencionar que Ping Zhou et al (2019) y Cruzado-Campos Jackeline (2021) realizaron una investigación sobre el efecto bioestimulante de Lessonia nigrescens teniendo una respuesta significativa en el rendimiento de los cultivares, esto coincide con los extractos etanólicos de Lessonia nigrescens, alga en estudio, que ha presentado un efecto de aplicación foliar teniendo una respuesta significativa en el rendimiento en las plantas de tomate. Para la determinación de la CL50 de los ensayos in vitro, se evidenció que el extracto etanólico de las hojas de Lessonia nigrescens posee una mayor efectividad nematicida, debido a que los componentes se consideran biológicamente activos cuando los valores de CL50 expresados en µg/L son inferiores a 1000 ppm. Asimismo, en las pruebas de bioensayo con las plantas de tomate, CL50 muestra que el extracto etanólico de las hojas de Lessonia nigrescens posee una importante actividad contra el Meloidogyne spp. 53 V. CONCLUSIONES Teniendo los resultados completos, se llegaron a las siguientes conclusiones: Con respecto a los ensayos in vitro:  El alga Lessonia nigrescens presenta efecto nematicida sobre el nematodo Meloidogyne spp.  Los extractos etanólicos (hojas y talos) a la concentración del 100% produjeron el 100% de mortandad en los nematodos J2 (juveniles estadío 2), a concentraciones de 50% se obtuvo una mortandad de 70.2 % para el extracto de talos y 96.4% para el extracto de hojas.  Se han identificado en el alga Lessonia nigrescens los siguientes metabolitos secundarios: triterpenos, saponinas (solo hojas), flavonoides, aminoácidos, grupos fenólicos, catequinas y antraquinonas (solo talos).  Con respecto al bioensayo de las plantas de tomate, el extracto etanólico de las hojas de Lessonia nigrescens presenta mayor efecto nematicida sobre Meloidogyne spp.a la concentración del 50% observándose un mayor crecimiento en raíces y follajes frescos.  La CL 50 obtenido del extracto etanólico de hojas de Lessonia nigrescens fue de 0.806mg/mL demostrándose la efectividad nematicida sobre el nematodo Meloidogyne spp.  Los efectos biométricos obtenidos de las plantas de tomate, indican que este extracto es un buen potenciador del crecimiento de las mismas 54 VI. RECOMENDACIONES  Proceder a la continuación de estudios similares para el control de nematodos haciendo uso de otras especies de algas marinas.  Continuar con la investigación haciendo uso de extractos metanólicos y acuosos del alga en estudio y verificar la efectividad de los mismos.  Realizar estudios comparativos de los efectos que pueden presentar los extractos de algas marinas, extractos botánicos y/o aceites esenciales contra el nematodo Meloidogyne spp, teniendo en cuenta su realización en diferentes estaciones del año y condiciones climatológicas.  Tomar en consideración para la medida del control del nematodo agallador, las características principales del mismo, tales como: morfología, adaptación, comportamiento, ciclo de vida, aspectos climatológicos y plantas con mayor susceptibilidad en infestación. 55 VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Callupe Francisco, Carrasco Sergio. Caracterización del departamento de Ica. Banco Central de Reserva del Perú Sucursal Huancayo: Dpto. Estudios Económicos; 2021. Disponible en: https://www.bcrp.gob.pe/docs/Sucursales/Huancayo/ica-caracterizacion.pdf 2. Espino Caballero Ricardo Florentino. Nematología Agrícola Texto Guía. consulta de nematología agrícola para estudiantes y agricultores. Universidad Nacional San Luis Gonzaga, Facultad de Agronomía, Departamento Académico de sanidad vegetal.2018. Disponible en: https://es.scribd.com/document/383076633/Libro-Papa-v1-180402-Imp-02- Abr-2018-Empaste. 3. Vilchis-Martínez Kathia *, Manzanilla-López Rosa Helena, John Powers Stephen, Montes Belmont Roberto. Efecto de extractos vegetales en crudo en el parasitismo de Pochonia chlamydosporia var. chlamydosporia sobre Meloidogyne incognita. Nematropica Vol. 43, No. 2, 2013. Disponible en: https://journals.flvc.org/nematropica/article/view/82716 4. Sepúlveda Jiménez, Gabriela; Porta Ducoing, Helena; Rocha Sosa, Mario. La Participación de los Metabolitos Secundarios en la Defensa de las Plantas. Revista Mexicana de Fitopatología, vol. 21, núm. 3, diciembre, 2003, pp. 355-363. Disponible en: https://www.redalyc.org/pdf/612/61221317.pdf 5. Surindar P, Tarjan A, Hodgson L. Effective Use of Marine Algal Products in the Management of Plant-Parasitic Nematodes 1. Journal of Nematology 19(2):194-200. 1999. Disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2618630/pdf/194.pdf 6. Ibrahim, D., Ghareeb, R., Abou El Atta, D., Azouz, H. Propiedades nematicidas de extractos metanólicos de dos algas marinas contra el nematodo agallador de la raíz del tomate, Meloidogyne incognita. Revista de Patología y Protección Vegetal, 2021; 12(2): 137-144. Disponible en: https://jppp.journals.ekb.eg/article_154414_dff8cd89d7f1896ccc3caa52881e88be.pdf 7. Ping Zou, Xueli Lu, Hongtao Zhao, Yuan Yua, Lei Meng, Chengsheng Zhang, et al. Polysaccharides Derived From the Brown Algae Lessonia nigrescens Enhance Sat Stress Tolerance to Wheat Seedlings by Enhancing the Antioxidant System and Modulating 56 Intracellular Ion Concentration. Front. Plant Sci. 2019 Enero; 10:48. Disponible en: https://www.frontiersin.org/journals/plant-science/articles/10.3389/fpls.2019.00048/full 8. El-Eslamboly, AASA, Abd El-Wanis, MM & Amin, AW. Aplicación de algas como método de control biológico del nematodo agallador Meloidogyne incognita en pepino en condiciones de cultivo protegidas y su impacto en el rendimiento y la calidad de la fruta. Egipto J Biol Pest Control 29, 18 (2019). Disponible en: https://ejbpc.springeropen.com/articles/10.1186/s41938-019-0122-z 9. Chao Zhao, Chengfeng Yang, Mingjun Chen, Xucong Lv, Bin Liu, Lunzhao Yi, et al. Regulatory Efficacy of Brown Seaweed Lessonia nigrescens Extract on the Gene Expressión Profile and Intestinal Microflora in Type 2 Diabetic Mice. Molecular nutrition Food Research. 2018 febr. 62(4). Disponible en: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/mnfr.201700730 10. Iler Iler Diana Carolina. Evaluación de la actividad nematicida in vitro de aceites esenciales frente a Meloidogyne. Tesis para optar el título de Ingeniera Bioquímica. Facultad de Ciencia e Ingeniería de Alimentos. Universidad Técnica de Ambato, Ecuador. 2017.49 p. Disponible en: https://repositorio.uta.edu.ec/jspui/handle/123456789/26608 11. Martinotti Marcelo Diego, Castellanos Sergio Juan, González Roxana, Camargo Alejandra, Fanzone Martin. Efecto Nematicida de extractos de ajo, orujos de uva y alperujo de aceituna; sobre Meloidogyne incognit, en vid, cv Chardonnay. Rev. Fac. Cien. Agrar., Univ. Nac. Cuyo. [Internet]. 2016 Jun [Recuperado 2022 abril 04]; 48 (1): 211-224. Disponible en: http://www.scielo.org.ar/scielo.php?script=sci_arttex&pid=S1853-86652016000100015 12. Lima-Medina Israel, Bravo Rosario Y., Aguilar-Gómez María I. Nemátodos fitoparásitos asociados al cultivo de Maiz (Zea mais L.) en las regiones de Puno y Cusco. Rev. Investiga. Altoandin. [Internet]. 2018 Ene [citado 2022 Abr 04]; 20(1): 31-38. Disponible en: http://www.scielo.org.pe/scielo.pphp?script=sci_arttext&pid=S2313- 29572018000100004&Ing=es. http://dx.doi.org/10.18271/ria.2018.328. 13. Lima-Medina Israel*; Bravo-Portocarrero Rosario Ysabel, Mamani-Cano Zhyla Danitza. Nemátodos fitoparásitos asociados al cultivo de quinua en la región de Puno-Perú. Rev. Investig. Altoandin. [Internet]. 2019 Oct [citado 2022 Abr 04]; 21 (4): 257-263. Disponible http://www.scielo.org.pe/scielo.pphp?script=sci_arttext&pid=S2313-29572018000100004&Ing=es http://www.scielo.org.pe/scielo.pphp?script=sci_arttext&pid=S2313-29572018000100004&Ing=es 57 en: http://www.scielo.org.pe/scielo.php?script=sci:_arttext&pid=S2313- 29572019000400003&Ing=es. http://dx.doi.org/10.18271/ria.2019.502 14. Cruzado Campos Jacqueline Milagros. Aplicación foliar de algas marinas en el Rendimiento y la calidad en dos cultivares de melón (Cucumis melo L.) en la Molina. Tesis para optar el título de Ingeniera Agrónoma. Facultad de Agronomía. Universidad Nacional Agraria La Molina. Lima, Perú 2021. 213 p. Disponible en: https://repositorio.lamolina.edu.pe/bitstream/handle/20.500.12996/4856/cruzado-campos- jacqueline-milagros.pdf?sequence=1&isAllowed=y 15. Solier Allcca Sonia. Rimache Allcca Wilson. Efecto de la aplicación foliar de tres fuentes de algas marinas en diferentes dosis en el cultivo de Sandí (Citrullus lanattus L.). hibrido Santa Amalia en la zona media del valle de Ica. Tesis para optar el título de Ingeniero agrónomo. Facultad de Agronomía. Universidad Nacional San Luis Gonzaga. Ica, Perú. 2019. 49 p. Disponible en: https://repositorio.unica.edu.pe/items/53ddf193-b00c-4b74-8a73- 6423568a2ee9 16. Huaroto Palacios Lorena. Valdivia Pillaca Maria. Efectividad Nematicida de Paecilomyces lilacinus sobre el cultivo de Vitis vinífera y Capsicum annuum, infestados con Meloidogyne spp. “Nematodo del Nódulo” Mayo a Agosto del 2018. Tesis para optar el título de Biólogo. Facultad de Ciencias Biológicas. Universidad Nacional San Luis Gonzaga. Ica, Perú. 2018. 45 p. Disponible en: https://repositorio.unica.edu.pe/items/0d851536-2c00-4077-9b7f- 10145ed45c55 17. Galindo Camacho Ruth Milagros. Efecto nematicida in vitro y en plantas de tomate de algas marinas Colpomenia sinuosa, Gracilariopsis lemaneiformis y Ulva papenfussii de la Bahía de Paracas sobre Meloidogyne incognita. Tesis para optar el título de Químico Farmacéuticos, Facultad de Farmacia y Bioquímica. Universidad Nacional San Luis Gonzaga. Ica, Perú. 2011. 49 p. Disponible en: Repositorio de la Universidad Nacional San Luis Gonzaga de Ica. 18. Varas Huaroto Noemí. Evaluación de la efectividad de extracto de Bidens pilosa L. para el control de Meloidogyne incognita (Kofoid y White) Chitwood en Lycopersicum esculentum variedad Rio Grande tomate in vitro y el tinglado en el Valle de Ica. Tesis para optar el título de Biólogo. Facultad de Ciencias Biológicas. Universidad Nacional San Luis Gonzaga. Ica, http://www.scielo.org.pe/scielo.php?script=sci:_arttext&pid=S2313-29572019000400003&Ing=es http://www.scielo.org.pe/scielo.php?script=sci:_arttext&pid=S2313-29572019000400003&Ing=es http://dx.doi.org/10.18271/ria.2019.502 58 Perú. 2011. 78 p. Disponible en: Repositorio de la Universidad Nacional San Luis Gonzaga de Ica. 19. Aragón B, Castillo R, Zavala J. Estudios sobre macroalgas pardas en el sur del Perú 2011 – 2015. Inst del mar del Perú. 2012; 1(1): p. 61-65. Disponible en: https://hdl.handle.net/20.500.12958/2179 20. Carbajal Patricia, Gamarra Alex. Guía para recolección y reconocimiento de macroalgas pardas comerciales del Perú. Instituto del Mar del Perú. Vol. 45 / No.2 / Abril - Junio 2018. Disponible en: https://repositorio.imarpe.gob.pe. 21. Arenas María. Determinación de los parámetros tecnológicos para la obtención de alginato de sodio a partir de aracanto (Lessonia nigrescens). Tesis de Título profesional Arequipa: Universidad Nacional de San Agustín; 2016. Disponible en: https://repositorio.unsa.edu.pe/items/4674c5ad-78cc-4aea-9d8f-b869f9531798 22. Ruiz A. Viabilidad en el desarrollo de esporas de Lessonia nigrescens bory en relación a estacionalidad y procedencia, norte y sur de Chile. Tesis de grado para optar al título de Ingeniero en Acuicultura. Puerto Montt: Universidad Austral de Chile; 2012. Disponible en: http://cybertesis.uach.cl/tesis/uach/2012/bpmfpr934v/doc/bpmfpr934v.pdf 23. Castro R, Zabaleta A. Programa en “BASIC” para el cálculo de DL50 por el método de Probit. Rev. Perú. med. exp. salud pública v.15 n.1-2 Lima ene./dic. 1998. Disponible en: http://www.scielo.org.pe/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1726-46341998000100009 24. Celis Álvaro, Mendoza F Cristina, Pachón Marco Eduardo. Uso de extractos vegetales en el manejo integrado de plagas, enfermedades y arvenses. Rev. Temas Agrarios. 2018 Marzo. 14 (1), 5-16. Disponible en: https://doi.org/10.21897/rta.v14i1.1205 25. Santamaría Celia, Martín-González Ana, Astorga Federico. Extractos vegetales en la aplicación para la reducción del estrés. European Natural Additives. Bedson Europ Marzo 2015. Disponible en: https://nutrinews.com/download/0315-ena-WEB.pdf 26. Villar A. Farmacognosia General. Madrid: Editorial Síntesis; 1999. Disponible en: https://es.scribd.com/document/348922895/Farmacognosia-General-Villar-Del-Fresno. 59 27. Frías María, Rosales Martha. Farmacognosia: Principios básicos. Universidad Juárez del Estado de Durango. 2023 Disponible en: https://books.google.es/books?id=zw73EAAAQBAJ&dq=tipos+de+extracci%C3%B3n+far macognosia&lr=&hl=es&source=gbs_navlinks_s 28. Nuñez Carlos. Extracciones con equipo Soxhlet. (cenunez.com.ar. 2008). Disponible en: https://www.studocu.com/latam/document/universidad-de-carabobo/quimica- organica/extraccion-con-equipo-soxhlet/8968500. 29. Sgariglia Melina, Soberon José, Sampietro Diego, Vattuone Marta. Cromatografía conceptos y aplicaciones. Arakuku. 2010. Disponible en: https://ri.conicet.gov.ar/bitstream/handle/11336/75465/CONICET_Digital_Nro.3655a360- b03b-44c8-8519-bc747d073f7c_A.pdf?sequence=2&isAllowed=y 30. Daniel, W. Bioestadística, base para el análisis de las ciencias de la salud. 4° ed. México: Editorial Limusa S.A; 2007. Disponible en: https://www.estadisticaparalainvestigacion.com/wp- content/uploads/2019/03/Bioestad%C3%ADstica-de-Daniel-Wayne.pdf 31. Hussey R, Barker K. A comparison of methods of collecting inoculate of Meloidogyne spp. including a new technique. Plant Dis. Reptr 1973; 57:1025-1028. Disponible en: https://www.cabidigitallibrary.org/doi/full/10.5555/19740810950 32. Bravo Ramos Carmen. Saravia Chaiña Milagros. Efecto Antimicrobiano in vitro del extracto de Lessonia nigrescens (ARACANTO) frente a Sthaphylococcus aureus, Escherichia coli y Cándida albicans. Tesis para optar el Título Profesional de Químico Farmacéutico, Facultad de Ciencias Farmacéuticas, Bioquímicas y Biotecnológicas. Universidad Católica de Santa María. Arequipa, Perú. 2019. 113p. Disponible en: https://repositorio.ucsm.edu.pe/items/ba956292-5084-41a5-9272-53d54ad82697 33. Huamani TicllaHuanaco Edgar. Extractos vegetales para el control del nematodo nodulador de la raíz Meloidogyne incognita, Kofoid y White 1919, Chitwood 1949. Tesis para optar Título Profesional de Ingeniero Agrónomo, Facultad de Agronomía. Universidad Nacional Agraria La Molina. Lima, Perú. 2022. 96p. Disponible en: https://repositorio.lamolina.edu.pe/bitstream/handle/20.500.12996/5461/huamani- ticllahuanaco-edgar.pdf?sequence=3&isAllowed=y 60 34. Hamed SM, El-Rhman AA, Abdel-Raouf N, Ibraheem BM (2018) Role of marine macroalgae in plant protection & improvement for sustainable agriculture technology. Beni- Suef University Journal of Basic and Applied Sciences 7: 104-110. Disponible en: DOI: 10.1016/j.bjbas.2017.08.002. 35. Mirella Romero-Bastidas et al. Macroalgas sobre la eclosión de huevecillos de Meloidogyne incognita y como bioestimulante en albahaca. Ecosistemas y Recursos Agropecuarios 9(3): e3404. Disponible en: https://www.scielo.org.mx/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S2007- 90282022000300013&lng=es&nrm=iso. 61 VIII. ANEXOS 62 ANEXO N° 1 63 ANEXO N° 2 Lavado Secado Cortado 64 ANEXO N° 3 Extracción por Maceración Extracción de Soxhlet Concentración del solvente 65 ANEXO N° 4 Fundo con parcelas infestadas Colocar una capa de papel toalla sobre el tamiz de plástico y adicionar la tierra Pesamos 50 cc de tierra 48 horas Identificación y conteo de M. spp (J2) 66 ANEXO N° 5 Tubos de ensayos con los extractos a probar Transferencia de 100 individuos de M. spp J2 a cada tubo de ensayo Permanencia en contacto con los tratamientos por 24 horas Transferencia a tubos de ensayo conteniendo agua potable por un espacio de 24 horas 1er conteo de individuos en posición de “rigor mortis” Conteo definitivo y verificación de resultados 24 horas 67 ANEXO N° 6 Raíces con nódulos Corte en trozos y pesamos 10 g Trasvase a la licuadora, se añadió hipoclorito de sodio 0,5 % y trituramos en 3 tiempos de 15 seg. cada uno Tamizamos y enjuagamos con agua potable Enrasamos a 100 ml con agua potable para la identificación y conteo de Huevos de M. spp/mL 68 ANEXO N° 7 Siembra de semillas Trasplante de plantines de tomate a macetas de 1 kg Infestación de 1000 huevos de M.spp Evaluación N°1 de población 1era aplicación de tratamientos Trasplante a raíz desnuda a macetas de 2 Kg 2da aplicación de tratamientos Evaluación N° 2 de población 3era aplicación de tratamientos Evaluación N° 3 de población Toma de datos biométricos (medición) Toma de datos biométricos (pesaje) Universidad Nacional “SAN LUIS GONZAGA” Facultad de Farmacia y Bioquímica Comisión de Grados Académicos y Títulos Profesionales FORMATO N°06 CARTA DE CONFORMIDAD DEL ASESOR DE TESIS Ica, 12 de Julio de 2024. Señor(a) Felipe Artemio Surco Laos Decano (a) de la Facultad de Farmacia y Bioquímica Universidad Nacional “San Luis Gonzaga” Presente. De mi consideración: Previo cordial saludo, por intermedio de la presente hago de su conocimiento que, en mi condición de ASESOR(A) de la TESIS titulada Efectividad Nemáticida in Vitro del alga marina Lessonia nigrescens sobre el nematodo Meloidogyne spp en plantas de Solanum lycopersicum en el distrito de Ica, presentada por la asesorada Ariana Del Carmen Ochoa Lizarzaburo para optar el Título Profesional de Químico Farmacéutico, ésta se encuentra en condiciones aptas para su presentación y sustentación de acuerdo al reglamento vigente, por lo que doy mi CONFORMIDAD. Así mismo asumo mi responsabilidad de asesor, indicando que he tenido cuidado de preservar los estándares de calidad correspondientes, de prevenir el plagio y proteger los derechos de autor, de acuerdo al D. L. N. º 822- Ley sobre el Derecho de Autor. Asimismo, declaro tener conocimiento de los efectos legales y administrativos que se deriven del incumplimiento o falsedad de la presente declaración, previsto en el artículo 411 del Código Penal y del artículo 32.3 de la Ley 27444, Ley de procedimiento Administrativo General. Lo que informo a Usted para la continuación de los trámites correspondientes. Ica, 12 de Julio del 2024 __________________________ Santos Haydee Chávez Orellana Asesora Nombres y Apellidos: Santos Haydee Chávez Orellana Correo Institucional: haydee.chavez@unica.edu.pe Celular: 956 696 923 Universidad Nacional “SAN LUIS GONZAGA” Facultad de Farmacia y Bioquímica Comisión de Grados Académicos y Títulos Profesionales FORMATO N°06 CARTA DE CONFORMIDAD DEL ASESOR DE TESIS Ica, 12 de Julio de 2024. Señor(a) Felipe Artemio Surco Laos Decano (a) de la Facultad de Farmacia y Bioquímica Universidad Nacional “San Luis Gonzaga” Presente. De mi consideración: Previo cordial saludo, por intermedio de la presente hago de su conocimiento que, en mi condición de ASESOR de la TESIS titulada Efectividad Nematicida in Vitro del alga marina Lessonia nigrescens sobre el nematodo Meloidogyne spp en plantas de Solanum lycopersicum en el distrito de Ica, presentada por la asesorada Ariana Del Carmen Ochoa Lizarzaburo para optar el Título Profesional de Químico Farmacéutico, ésta se encuentra en condiciones aptas para su presentación y sustentación de acuerdo al reglamento vigente, por lo que doy mi CONFORMIDAD. Así mismo asumo mi responsabilidad de asesor, indicando que he tenido cuidado de preservar los estándares de calidad correspondientes, de prevenir el plagio y proteger los derechos de autor, de acuerdo al D. L. N. º 822- Ley sobre el Derecho de Autor. Asimismo, declaro tener conocimiento de los efectos legales y administrativos que se deriven del incumplimiento o falsedad de la presente declaración, previsto en el artículo 411 del Código Penal y del artículo 32.3 de la Ley 27444, Ley de procedimiento Administrativo General. Lo que informo a Usted para la continuación de los trámites correspondientes. Ica, 12 de Julio del 2024 ______________________________ Ricardo Florentino Espino Caballero Asesor Nombres y Apellidos: Ricardo Florentino Espino Caballero Correo Institucional: ricardofespino@hotmail.com Celular: 956 626 542