Reconocimiento-NoComercial 4.0 Internacional Esta licencia permite a otras distribuir, combinar, retocar, y crear a partir de su obra de forma no comercial y, a pesar que son nuevas obras deben siempre rendir crédito y ser no comerciales, no están obligadas a licenciar sus obras derivadas bajo los mismos términos. http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0 http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/ http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0 http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/ UNIVERSIDAD NACIONAL “SAN LUIS GONZAGA” VICERRECTORADO DE INVESTIGACIÓN Facultad de Farmacia y Bioquímica TITULO: Determinación de la Actividad Antioxidante y Evaluación de la Toxicidad Aguda del extracto etanólico de la parte aérea de Helenium aromaticum (Hook.) L.H. Bailey “Manzanilla Macho” Línea de investigación: Salud pública y consevación del medio ambiente Autor: Bach. Ramos De La Cruz, Kevin Eduardo Ica – Perú 2021 ii DEDICATORIA A Dios, por permitirme llegar a este momento tan especial en mi vida. Por los logros y enseñanzas que me ha brindado para poder, valorarlo, cada día, más, a mis, padres, por ser las, personas que, han sabido, guiarme, y las, cuales admiro, por todos los, sacrificios que realizaron, para que pueda culminar, mi carrera profesional. A mis asesores, por el tiempo, dedicado, por su, apoyo, así como por,la sabiduría que, me transmitieron, en el desarrollo,de mi formación, profesional. iii AGRADECIMIENTOS A DIOS Por brindarme salud y bendición para alcanzar mis metas como persona y como profesional. A MIS PADRES Por esforzarse en darme una carrera para mi futuro, por creer en mí, aunque hemos pasado momentos difíciles siempre han estado apoyándome y brindándome todo su amor. Este trabajo que me llevó meses hacerlo es para ustedes, por ser mi motor y motivo. A MI HERMANA Por ser mí guía y por forjar en mí, bases de responsabilidad y deseos de superación. Este proyecto no fue fácil, pero estuviste motivándome y ayudándome hasta donde tus alcances lo permitían. Sus infinitas virtudes y su gran corazón, hacen que la admire cada día más. A MIS ASESORES Dra. Santos Haydee Chávez Orellana, Dr. Felipe Artemio Surco Laos y Dr. Ernesto Torres Veliz. Durante la realización de mi proyecto, ustedes han sido las personas quien me han guiado en el complicado proceso. Es cierto, no ha sido nada fácil, sin embargo, gracias a su ayuda, el proceso fue un tanto menos complicado. El resultado de mi tesis ha sido espectacular y una gran parte del desarrollo de este excelente trabajo se lo debo a ustedes. Finalmente, a todas aquellas personas, colegas y amigos que me brindaron su apoyo e informacion para el logro de mis objetivos. GRACIAS iv INDICE Pág. PORTADA .................................................................................................................... i DEDICATORIA ............................................................................................................ ii AGRADECIMIENTOS ................................................................................................. iii INDICE DE CONTENIDO ........................................................................................... iv INDICE DE TABLAS ................................................................................................... vi INDICE DE FIGURAS ................................................................................................. vii RESUMEN .................................................................................................................... ix ABSTRACT .................................................................................................................. x I. INTRODUCCIÓN Descripción de la realidad problemática ............................................................... 12 Problema General ................................................................................................... 12 Problemas Especificos ........................................................................................... 12 Antecedentes internacionales ................................................................................. 13 Antecedentes nacionales ........................................................................................ 13 Justificación e importancia ..................................................................................... 14 Objetivo General .................................................................................................... 15 Objetivos Especificos ............................................................................................. 15 Hipótesis y Variables de la investigación .............................................................. 15 1.1. Marco teórico .......................................................................................................... 17 1.1.1. Clasificación botánica .......................................................................................... 17 1.1.2. Actividad antioxidante ......................................................................................... 17 1.1.2.1. Tipos de antioxidantes ...................................................................................... 17 1.1.3. Vitamina C ........................................................................................................... 19 1.1.4. Antioxidantes en los alimentos ............................................................................ 20 v 1.1.5. Fuentes naturales de los antioxidantes ................................................................. 20 1.1.6. Radicales libres .................................................................................................... 20 1.1.7. Estrés oxidativo .................................................................................................... 22 1.1.8. Envejecimiento y patologías ................................................................................ 23 1.1.9. Polifenoles ........................................................................................................... 23 1.1.10. Flavonoides ........................................................................................................ 25 1.1.11. Métodos de evaluación de la actividad antioxidante ......................................... 26 1.1.12. Toxicidad ........................................................................................................... 27 1.2. Marco Conceptual ................................................................................................... 29 II. ESTRATEGIA METODOLÓGICA 2.1. Tipo, Nivel y Diseño de Investigación ................................................................... 30 2.2. Población y Muestra ............................................................................................... 30 2.3. Técnicas y Procedimientos de recolección de datos ............................................... 30 2.4. Técnicas de procesamiento de la información ........................................................ 31 2.5. Aspectos Éticos ....................................................................................................... 33 III. RESULTADOS ...................................................................................................... 34 IV. DISCUSIÓN ........................................................................................................... 37 V. CONCLUSIONES................................................................................................... 38 VI. RECOMENDACIONES ....................................................................................... 39 VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................... 40 VIII. ANEXOS ............................................................................................................. 49 vi INDICE DE TABLAS TABLA 1. Operacionalización de las variables ............................................................ 16 TABLA 2. Fuentes comunes de radicales libres y fuentes comunes de antioxidantes ....................................................................................................................................... 23 TABLA 3. Escala de rangos, grados o estimaciones de toxicidad aguda (ETA) en función a la DL50 de la sustancia diseñado por John William Trevan .......................... 28 TABLA 4. Metabolitos secundarios presentes en el extracto etanólico de la parte aérea de Helenium aromaticum (Hook.) L.H. Bailey “Manzanilla macho” .................. 34 TABLA 5. Resultados de la prueba de toxicidad aguda del extracto etanólico de la parte aérea de Helenium aromaticum (Hook.) L.H. Bailey “Manzanilla macho”. ........ 36 TABLA 6. Porcentaje de inhibición del radical DPPH de la Fracción “A” del extracto etanólico de la parte aérea de helenium aromaticum (hook.) l.h. bailey “manzanilla macho” ....................................................................................................... 64 TABLA 7. Porcentaje de inhibición del radical DPPH de la Fracción “C” del extracto etanólico de la parte aérea de helenium aromaticum (hook.) l.h. bailey “manzanilla macho” ....................................................................................................... 64 TABLA 8. Porcentaje de inhibición del radical DPPH de la Fracción “D” del extracto etanólico de la parte aérea de helenium aromaticum (hook.) l.h. bailey “manzanilla macho” ....................................................................................................... 65 TABLA 9. Porcentaje de inhibición del radical DPPH de la Fracción “E” del extracto etanólico de la parte aérea de helenium aromaticum (hook.) l.h. bailey “manzanilla macho” ........................................................................................................................... 65 vii INDICE DE FIGURA FIGURA 01. Parte aérea de la planta Helenium aromaticum (Hook.) L.H. Bailey “manzanilla macho” ....................................................................................................... 14 FIGURA 02. Estructura química de la Vitamina A ...................................................... 19 FIGURA 03. Estructura química de la Vitamina E....................................................... 19 FIGURA 04. Estructura del ácido L-ascórbico y ácido isoascórbico ........................... 20 FIGURA 05. Antioxidantes como secuestradores de radicales libres .......................... 20 FIGURA 06. Consecuencias de las ERO en enfermedades y el papel preventivo de los polifenoles. ............................................................................................................... 24 FIGURA 07. Estructura principal de flavonoides ......................................................... 25 FIGURA 08. Flavonoides, estructura básica y tipos. .................................................... 26 FIGURA 09. Método de captación del radical 2,2-difenil-1-picril-hidrazilo (DPPH). La actividad antioxidante de una muestra se expresa en IC50 (concentración mínima necesaria para inhibir al 50% el (DPPH). ...................................................................... 27 FIGURA 10. Zona de Molletambo distrito de Yauca del Rosario - Ica ....................... 31 FIGURA 11. Capacidad antioxidante de las Fracciones obtenidas a partir del extracto etanólico de la parte aérea de Helenium aromaticum (Hook.) L.H. Bailey “Manzanilla macho” mediante el método de DPPH. Constancia del Herbario ....................................................................................................................................... 35 FIGURA 12. Constancia del Herbario .......................................................................... 49 FIGURA 13. Recolección y Pre-Selección de la planta Helenium aromaticum “Manzanilla macho” ...................................................................................................... 51 FIGURA 14. Flujograma del tratamiento de la muestra vegetal de la parte aérea de H. aromaticum (Hook.) L.H. Bailey. ............................................................................. 52 FIGURA 15. Flujograma de la obtención del extracto etanólico de la parte aérea de H. aromaticum (Hook.) L.H. Bailey. Mediante el método de maceración .................... 53 FIGURA 16. Flujograma del fraccionamiento del extracto etanólico de la parte aérea de H. aromaticum (Hook.) L.H. Bailey. ........................................................................ 56 FIGURA 17. Flujograma del Screening Fitoquímico. .................................................. 57 viii FIGURA 18. Identificación de los metabolitos secundarios de la fracción “A” del extracto etanólico de la parte aérea de H. aromaticum (Hook.) L.H. Bailey. ................ 58 FIGURA 19. Identificación de los metabolitos secundarios de la fraccion “B” del extracto etanólico de la parte aérea de H. aromaticum (Hook.) L.H. Bailey. ................ 59 FIGURA 20. Identificación de los metabolitos secundarios de la fraccion “C” del extracto etanólico de la parte aérea de H. aromaticum (Hook.) L.H. Bailey. ................ 60 FIGURA 21. Identificación de los metabolitos secundarios de la fraccion “D” del extracto etanólico de la parte aérea de H. aromaticum (Hook.) L.H. Bailey. ................ 61 FIGURA 22. Identificación de los metabolitos secundarios de la fraccion “E” del extracto etanólico de la parte aérea de H. aromaticum (Hook.) L.H. Bailey. ................ 62 FIGURA 23. Determinación de la actividad antioxidante de la Fracción D del extracto etanólico de la planta Helenium aromaticum “Manzanilla macho” mediante la decoloración del catión radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH·). ...................... 63 ix RESUMEN DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE Y EVALUACIÓN DE LA TOXICIDAD AGUDA DEL EXTRACTO ETANÓLICO DE LA PARTE AÉREA DE Helenium aromaticum (Hook.) L.H. Bailey “MANZANILLA MACHO” Objetivos. Determinar la actividad antioxidante del extracto etanólico de la parte aérea de Helenium aromaticum (Hook.) L.H. Bailey “Manzanilla macho”. Evaluar el grado de toxicidad aguda en modelos animales. Materiales y métodos. Para determinar el efecto antioxidante se utilizó el método del DPPH hasta obtener la IC50. Para evaluar el grado de toxicidad aguda se utilizó 18 ratones divididos en 2 grupos: Un grupo a la dosis de 2000 mg/Kg y otro grupo que recibió solo el vehículo (grupo control). Resultados. En la actividad antioxidante, el IC50 de la fracción D fue de 0.462 mg/mL, mientras que la fracción A, C y E fue de (3.049 mg/mL, 9.945 mg/mL, 2.673 mg/mL respectivamente). Respecto a la toxicidad, la dosis límite de 2000 mg/Kg de masa corporal provocó la muerte total de los ratones (9 ratones). Conclusiones. La fracción D obtenida del Screening Fitoquímico presenta mayor actividad antioxidante que las otras fracciones propuestas. Palabras clave: Antioxidante, DPPH, Helenium aromaticum, Toxicidad aguda x ABSTRACT DETERMINATION OF ANTIOXIDANT ACTIVITY AND ASSESSMENT OF ACUTE TOXICITY OF ETHANOL EXTRACT FROM THE AERIAL PART OF Helenium aromaticum (Hook.) L.H. Bailey "MALE CHAMOMILE" Goals. To determine the antioxidant activity of the ethanolic extract of the aerial part of Helenium aromaticum (Hook.) L.H. Bailey "Male Chamomile." Evaluate the degree of acute toxicity in animal models. Materials and methods. To determine the antioxidant effect, the DPPH method was used until obtaining the IC50. To evaluate the degree of acute toxicity, 18 mice divided into 2 groups were used: A group at the dose of 2000 mg / Kg and another group that received only the vehicle (control group). Results. In antioxidant activity, the IC50 of fraction D was 0.462 mg / mL, while fraction A, C and E was (3.049 mg / mL, 9.945 mg / mL, 2.673 mg / mL respectively). Regarding toxicity, the limit dose of 2000 mg / Kg of body mass caused the total death of the mice (9 mice). Conclusions. Fraction D obtained from the Phytochemical Screening shows greater antioxidant activity than the other proposed fractions. Keywords: Antioxidant, DPPH, Helenium aromaticum, Acute toxicity 11 I. INTRODUCCIÓN Los antioxidantes, son moléculas, que interactúan, con los radicales, libres en, cualquier, etapa (Iniciación, propagación, terminación, descomposición o posterior, oxidación) (1). Por otra parte, los prooxidantes, son los considerados, radicales, libres, capaces, de inducir estrés, oxidativo, provenientes, de una gran variedad, de fuentes (2). Desde un punto de vista fitoquímico, los antioxidantes derivados de las plantas pueden ser: taninos, lignanos, estilbenos, cumarinas, quinonas, xantonas, ácidos fenólicos, flavones, flavonoles, catequinas, antocianinas y proantocianinas los cuales debido a sus propiedades redox pueden actuar como donadores de hidrógenos, ayudando a la prevención o retraso en el desarrollo de enfermedades degenerativas (3). El estrés oxidativo surge debido a una disminución de la capacidad antioxidante del sistema o en sistemas biológicos luego de una prolongada exposición a oxidantes, relacionándose con la generación de radicales libres como las especies reactivas oxigenadas (EROs) (4,5). El exceso, de radicales, libres, puede causar, la inhibición, de algunas, enzimas, como superóxido, dismutasa, catalasas, y peroxidasas. Generando, efectos mortales, en las, células por, la oxidación, de DNA, proteínas, lípidos y enzimas; pudiendo prolongar, la producción, de más radicales, libres y aumentando, el daño de, tejidos. Sin embargo, los agentes, antioxidantes pueden, inhibir o interrumpir, las reacciones, de transformación, que originan daños, a las mencionadas, biomoléculas (6). En el Perú, se utiliza empíricamente, alrededor de 1 400 especies de plantas con fines medicinales, cuyo uso popular se registra durante miles de años (7,8). Estas especies poseen gran variedad de moléculas orgánicas (Flavonoides en su mayoría), capaces de captar radicales libres causantes del estrés oxidativo, ayudando a la prevención de enfermedades cardiovasculares, circulatorias, cancerígenas y neurológicas. La especie, Helenium aromaticum (Hook.) L.H. Bailey se, puede, encontrar, de manera habitual, en Chile y se distribuye, desde, Valparaíso, (Aconcagua), hasta la, Concepción, conocida, por sus pobladores, como “manzanilla del, campo”, “manzanilla del, cerro” (9); y en el, Perú se encuentra, distribuida en los, departamentos de, Ica, Arequipa, Ayacucho, conocida, por sus pobladores, como “manzanilla, macho” (10, 11). Esta planta es empleada en la medicina tradicional como antinflamatoria en diversas afecciones asociadas a procesos inflamatorios y ya que contiene diversos metabolitos, pudiera comportarse como un potente antioxidante; sin embargo, no existen investigaciones que corroboren dicho uso para esta planta, ni que avalen su seguridad por vía oral, por lo que es preciso realizar estudios farmacológicos y toxicológicos en este sentido. 12 El objetivo fundamental de esta investigación científica será determinar la actividad antioxidante y evaluar la toxicidad aguda de esta especie. Descripción de la realidad problemática El oxígeno es el combustible necesario para la vida, pero nos hace pagar un importante precio por ello, la oxidación, convirtiéndolo en nuestro principal agresor (12) . Lo cierto es que todos los seres vivos que emplean oxígeno para generar energía, liberan radicales libres (13) . Los radicales libres son partículas inestables que han perdido un electrón y son altamente reactivas (14) . Los radicales libres son fabricados por nuestro propio organismo, pero en cantidades moderadas para combatir contra bacterias y virus. Pero a la vez, estos radicales libres son neutralizados fácilmente por nuestro propio sistema antioxidante. El aumento de radicales libres por encima de la cantidad de agentes antioxidantes, origina un estrés oxidativo, lo que produce daño celular (15) . El exceso sostenido de radicales libres en nuestro sistema a través de los años, originan que nuestro sistema antioxidante requiera de los antioxidantes de la dieta (16) . Conforme la tecnología avanza, algunas industrias farmacéuticas usan los antioxidantes procedentes de las plantas, en medicina y como preservantes en alimentos (quercetina,,tocoferol y ,caroteno), semejante con los antioxidantes sintéticos, de mayor uso como 2-terbutilhidroxitolueno (BHT) y 2-terbutilhidroxianisol (BHA); presentando la desventaja de ser tóxicos (17). Los antioxidantes naturales están despertando mayor interés en la población, debido principalmente a que son innatamente más seguros que los compuestos sintéticos y debido a la eficacia que puede producir la gran variedad de agentes fitoquimicos, coadyuvando de manera positiva la patología de las enfermedades crónicas y el proceso de envejecimiento. Por lo expuesto anteriormente nos planteamos la siguiente pregunta de investigación. Formulación del Problema Problema general ¿El extracto etanólico de la parte aérea de Helenium aromaticum (Hook.) L.H. Bailey “Manzanilla macho” presentará actividad antioxidante y toxicidad aguda? Problemas específicos PE1. ¿Tendrá el extracto etanólico de la parte aérea de Helenium aromaticum (Hook.) L.H. Bailey “Manzanilla macho” metabolitos secundarios? PE2. ¿Tendrá el extracto etanólico de la parte aérea de Helenium aromaticum (Hook.) L.H. Bailey “Manzanilla macho” actividad antioxidante? 13 PE3. ¿Cuál será el grado de toxicidad del extracto etanólico de la parte aérea de Helenium aromaticum (Hook.) L.H. Bailey “Manzanilla macho”? Antecedentes Internacionales Wener et al. (1963), en México reportaron, por primera vez, la estructuras de las, lactonas, sesquiterpénicas de la especie, Helenium: Helenalina, balduilina,, mexicanina-1 y, neohelenalina (mexicanina D) (23). Romo y Nathan (1963), en Chile, reportaron, los constituyentes, de Helenium aromaticum (Hook.) L.H. Bailey y, las estructuras de, aromatin y, aromaticin por, primera vez, aislando la, helenalina, mexicanin I y, dos nuevas lactonas, sesquiterpénicas; aromatin y, aromaticin (24). Clark (1982), en EE.UU. realizó, un estudio, de una sustancia, amarga que produce, estornudos aislada, de Helenium, autumnale. Proponiendo como nombre, “Helenalina” (25). Alvarenga et al. (2001), en Brasil, realizaron un, estudio de compuestos naturales, aislados de, asteraceae, reportando la, presencia de, lactonas, sesquiterpénicas y, flavonoides para la tribu, heleniaea (26). Barrera et al. (2011), en México, evaluaron, la actividad, antibacteriana de ocho, extractos diferentes, de las flores de Helenium, mexicanum HBK; frente, a 10 bacterias, patógenas humanas, mediante, los métodos: disco, de difusión, dilución, en caldo y bioautografía (27). Antecedentes Nacionales Hernández Peña Marcos Joel, Mendoza Bautista Roberto Carlos (2014) en Perú realizaron un estudio de Aislamiento y elucidación estructural de los metabolitos secundarios presentes en Helenium aromaticum (Hook.) L.H. Bailey “manzanilla macho” y evaluación de la actividad antibacteriana (28). Hernández Peña Marcos Joel et al. (2018), realizaron un estudio del Perfil metabolómico por HPLC-ESI-MS-MS en la fraccion gastroprotectora de Helenium aromaticum (Hook.) L.H. Bailey “manzanilla macho” (29). 14 Figura 01. Parte aérea de la planta Helenium aromaticum (Hook.) L.H. Bailey “manzanilla macho” Fuente: Dick Culbert from Gibsons, B.C., Canada Justificación e Importancia En la actualidad existen varios productos alimenticios que contienen antioxidantes sintéticos, pero a la vez, existen numerosas alternativas de antioxidantes naturales, entre los cuales se encuentran la vitamina C y los compuestos polifenólicos, ampliamente estudiados por su efecto para contrarrestar algunas enfermedades degenerativas. Los antioxidantes son sustancias que inhiben o retardan el proceso oxidativo, cuya actividad podría deberse a sus componentes polifenólicos (18) . Los polifenoles son compuestos con actividad antioxidante, presentes en las plantas y alimentos. Dentro de este grupo, se encuentran los flavonoides que son sustancias que manifiestan potente actividad antioxidante (19) . Las plantas poseen diferentes sustancias antioxidantes, por lo cual sería difícil determinar la cantidad en la que se encuentra en cada una de las diferentes especies. Existen varias divulgaciones científicas en cuanto al conocimiento de las enfermedades y su tratamiento, pero aun existen muchas dudas relacionadas al origen (20) . En los últimos 15 años se ha incrementado el predominio de las enfermedades crónicas y enfermedades no transmisibles, siendo más frecuentes las enfermedades cardiovasculares y diversos tipos de cáncer, consideradas como las dos primeras causas de muerte, siendo las sustancias oxidantes, uno de los principales factores de riesgo asociado con su desarrollo (21) . El oxígeno, se encuentra generalmente en su forma más estable (O2) pero algunas veces puede ocurrir que, por exposición a radiaciones ionizantes, contaminación del medio ambiente, exposición a rayos ultravioleta, entre otras, se originen, las especies, reactivas de, oxígeno (EROs), teniendo como objetivo, principal la molécula, de ADN. Estos daños que los origina los radicales libres, están íntimamente vinculados con el origen de enfermedades como el cáncer (22) . Objetivos de la investigación Objetivo General Determinar la actividad antioxidante y evaluación de la toxicidad aguda del extracto etanólico de la parte aérea de Helenium aromaticum (Hook.) L.H. Bailey “Manzanilla macho”. Objetivos Específicos: OE1. Identificar mediante un screening fitoquímico los posibles metabolitos responsables de la actividad antioxidante del extracto etanólico de la parte aérea de Helenium aromaticum (Hook.) L.H. Bailey “Manzanilla macho”. OE2. Determinar la actividad antioxidante del extracto etanólico de la parte aérea de Helenium aromaticum (Hook.) L.H. Bailey “Manzanilla macho”. OE3. Evaluar características de toxicidad aguda del extracto etanólico de la parte aérea de Helenium aromaticum (Hook.) L.H. Bailey “Manzanilla macho”. Hipótesis y variables de la Investigación Hipótesis H1. El extracto etanólico de la parte aérea de Helenium aromaticum (Hook.) L.H. Bailey “Manzanilla Macho” presenta metabolitos secundarios. H2. El extracto etanólico de la parte aérea de Helenium aromaticum (Hook.) L.H. Bailey “Manzanilla Macho” presenta alta actividad antioxidante. H3. El extracto etanólico de la parte aérea de Helenium aromaticum (Hook.) L.H. Bailey “Manzanilla Macho” no presenta características tóxicas a dosis de 2000 mg/Kg. 16 Variables TABLA 1. Operacionalización de las variables Variable Dimensión Indicador Escala de medición V. Independiente Extracto etanólico de la parte aérea de Helenium aromaticum (Hook.) L.H. Bailey “Manzanilla macho” Estudio Fitoquímico Análisis organolépticos: Olor, Textura y Color Nominal Metabolitos secundarios: - Flavonoides. - Aminoacidos. - Triterpenoides. - Quinonas. - Alcaloides. - Catequinas. - Lactonas sesquiterpenicas. Nominal V. Dependiente Actividad Antioxidante Capacidad antioxidante total Método DPPH IC50 Toxicidad Aguda Características de la toxicidad aguda Mortalidad N° de animales muertos del grupo control vs N° de animales muertos del grupo tratado Estudio macroscópico de principales órganos Comparación del cambio de tamaño y color de los órganos del grupo control vs grupo tratado Peso corporal (g) Peso corporal promedio del grupo control vs grupo tratado a los 7 y 14 días. Signos y síntomas Si presenta / No presenta (temblores, convulsiones, micción, defecación, letargo) 17 1.1. MARCO TEÓRICO 1.1.1. Clasificación botánica La muestra vegetal completa ha sido estudiada y clasificada como: Helenium aromaticum (Hook.) L.H. Bailey, por el Dr. Hind, D.J. Nicholas, investigador responsable en Asteráceas del Royal Botanic Gardens, Kew - UK; y tiene. la siguiente. posición taxonómica, según. el sistema de clasificación. de Arthur. Cronquist (1981) “In Integrated System of Classification of Flowering Plants”. La taxonomia, nombre vulgar, sinonimos, descripción de la especie, distribución y usos se encuentran en Anexos (30, 31, 32, 33, 34, 35). 1.1.2. Actividad antioxidante Los antioxidantes de origen vegetal son un conjunto de fitoquímicos tales como los carotenoides, antocianinas, flavonoides y vitaminas, entre los más importantes. Los antioxidantes son compuestos que son capaces de prevenir e incluso disminuir los daños causados en tejido humano por el efecto normal de oxidación fisiológica (36) . Existen diferentes maneras para determinar la actividad antioxidante, utilizando distintos métodos para la generación de radicales libres; pero dependerá de la capacidad antioxidante que tenga la planta, para poder inhibirlos (37) . Los antioxidantes neutralizan la acción oxidante de los radicales libres, sin perder su estabilidad electroquímica. Los antioxidantes donan electrones y evitan que los radicales libres los capten de las células (38) . Los flavonoides como antioxidantes pueden ayudar a proporcionar protección contra estas enfermedades. Actualmente, existen antioxidantes sintéticos que son comercialmente accesibles, pero pueden ser tóxicos. Por ello, es importante encontrar y desarrollar nuevas técnicas para determinar antioxidantes de origen natural que sean seguras (39) . 1.1.2.1. Tipos de antioxidantes A) Antioxidantes primarios (sistema enzimático) Previenen la formación de nuevos radicales libres. Este sistema enzimático es el primer nivel de defensa antioxidante y se origina al interior del organismo. Esto se consigue convirtiendo las ERO en moléculas menos dañinas, antes de que puedan reaccionar, o evitando su producción a partir de otras moléculas. En este grupo se destacan las siguientes enzimas encargadas de mantener niveles aceptables de radicables libres en nuestras células (41) : 18  El glutatión peroxidasa (GPx), Perteneciente a una familia de enzimas con actividad peroxidasa. La GPx se define como una glicoproteína tetramérica que tiene como cofactor al selenio. En las células animales se encuentra en la matriz mitocondrial y en el citosol. Se han descrito isoformas de GPx, que difieren tanto en su localización, como en su especificidad hacia el sustrato. La GPx fosfolípido hidroperóxido, tiene como función principal proteger al organismo contra la peroxidación lipídica a nivel de membranas y de las lipoproteínas de baja densidad (40) .  Coenzimas superóxido, regulan la cantidad de oxígeno que ingresan a las células y así evitan una oxidación elevada de las células.  La catalasa, tiene la función de poder captar los radicales libres y convertirlos en agua y oxígeno, beneficiando así a las células, tiene acción neuroprotectora, ayudando en los procesos inflamatorios del sistema nervioso, funcionando dentro de la célula como antioxidante no enzimático, con capacidad de aceptar los electrones perdidos por las moléculas. B) Antioxidantes secundarios (sistema no enzimático) Los antioxidantes secundarios constituyen la segunda defensa antioxidante y capturan los radicales libres que se han formado, para evitar las reacciones en cadena o interrumpiendo su propagación. Ejemplos de ellos son la vitamina C, E, B-caroteno y sustancias endógenas con poder antioxidante (Glutatión urato, bilirrubina y ubiquinona) (41) . C) Según otros autores Según Dávila (42) , existen antioxidantes que ayudan a protegernos de la formación, de radicales, libres, entre ellas, tenemos:  Citroflavonoides: Como la hesperidina y la rutina. Presentes en ciruelas, uvas, manzana, melon, etc.  Coenzima Q10: Presentes en los pescados como las sardinas, salmon y caballa.  Ácido gama linoleico: Presentes en los aceites vegetales.  El glutation: Presentes en las espinacas, sandías, fresas, ajo y tomates,  Zinc: Presente en las legumbres, carnes, pescados, cereales, etc.  Selenio: Presente en verduras, mariscos, pescados, verduras y levadura de cerveza.  Superóxidos dismutasa (SOD): Presente en el zapallo, trigo, etc. 19  Vitamina A: Conocida también como “Retinol” liposoluble (44) . Presente en las espinacas, camote, zanahorias, manzana, tomate, brócoli, etc. Figura 02. Estructura química de la Vitamina A Fuente: Robinson (1991)  Vitamina E: Conocida también como “Tocoferol” (43) . Es una vitamina liposoluble que actúa como antioxidante protegiendo el tejido corporal del daño originado por los radicales libres (45) , presente en las almendras, espinacas, aceites vegetales, etc. Figura 03. Estructura química de la Vitamina E Fuente: FELIPE Y POSUELO (2004) 1.1.3. Vitamina C La vitamina C, es una importante, vitamina hidrosoluble, con actividad antioxidante por, su alta capacidad de donar, un electron y lograr, regresar a su forma, reducida (46) . Se degrada fácilmente, por cambios de temperatura, radiación y alta, concentración de oxígeno. Esta vitamina, se encuentra, biodisponible en frutas, hortalizas, zumos y alimentos fortificados. Gracias, a su estructura, en forma de ácido, ascórbico (mayor actividad biológica). La deficiencia, de vitamina C, genera escorbuto, que esta, asociada a la susceptibilidad, de presentar, infecciones, fatiga y debilidad, muscular. En niños, es causa de, anormalidades y hemorragias, óseas (47) . Aproximadamente el 90% de la vitamina C ingerida en la dieta resulta de vegetales frescos, verduras y frutas, de carácter ácido, preferiblemente crudas o cocidas por muy poco tiempo y servidas de inmediato. Siendo sus fuentes principales los cítricos, fresas, pimientos, tomates, coles y brócoli. El contenido de vitamina C en frutas y verduras varía dependiendo del grado de madurez de las mismas, siendo menor cuando están verdes, aumenta su cantidad cuando están en su punto y luego vuelve a disminuir (48) . 20 Figura 04. Estructura del ácido L-ascórbico y ácido isoascórbico Fuente: Barbany J, Javierre C. Archivos de Medicina del deporte. (2006). 1.1.4. Antioxidantes en los alimentos En nuestro sistema, existe un equilibro, de agentes oxidantes/antioxidantes, en la cual, por diversos, factores se produce un estrés oxidativo, que está ligado a, muchos procesos, fisiopatológicos. Es por ello, que es importante, el consumo de agentes, naturales para continuar, manteniendo el equilibrio, o incluso, a favor de los agentes, antioxidantes. 1.1.5. Fuentes naturales de los antioxidantes Según Aquino (49) , la capacidad, antioxidante que poseen, los vegetales, se debe, a la presencia de polifenoles, capaces de retener, los radicales, libres. Para Middleton y Kandaswami (50) , Rice-Evans (51) . Los polifenoles son potentes agentes antioxidantes con efectos anticarcinogénicos y antimutagénicos. La actividad antioxidante se debe a la presencia de un numero variable de grupos hidroxilo fenólicos en su estructura química, los mismos que reaccionan con los radicales libres (Figura 05). Figura 05. Antioxidantes como secuestradores de radicales libres Fuente: Sakakibara (52) 1.1.6. Radicales libres Los radicales, libres con aquellas especies, químicas que presentan, un electrón, desapareado o impar, en su estructura, generando, así una inestabilidad. Estos radicales, libres son a la, vez muy reactivos, y con una vida media, corta. Dentro de 21 las fuentes, de sustancias, oxidantes, tenemos dos grupos, endógenas y, exógenas (53) . Entre los daños que pueden ocasionar los radicales libres en las células tenemos: - Pérdida de identidad de la célula, ocasionada por la destrucción de las proteínas de la membrana celular. - Fusión entre los lípidos y las proteínas de la membrana, endureciéndola, haciéndola más frágil y quebradiza. - Ruptura de la membrana celular permitiendo el fácil ingreso de las bacterias y virus. El daño, que puede generar, los radicales libres, como resultado, esta relacionado, a diversos procesos, patológicos, como cancer, insuficiencia renal, diabetes mellitus, hipertensión e incluso, en mismo proceso, de envejecimiento (54) . El origen, de los radicales libres, puede deberse, de varias maneras, como, por ejemplo, el estrés oxidativo, producido durante, el ejercicio físico, por drogas, bacterias o virus (55) . Pero a la, vez cabe indicar, que los radicales libres, no son totalmente, dañinos, ya que nuestro, organismo los, produce de manera moderada, para luchar contra, bacterias y virus. Nuestro propio, sistema inmune, neutraliza fácilmente, los radicales, libres producidos, por el cuerpo, para llevar a, cabo funciones, específicas. Con el paso, de los años, se produce un, exceso sostenido, de radicales, libres en nuestro, sistema, momento en el, cual son necesarios, los antioxidantes de la dieta. El aumento de radicales, libres por encima, de la cantidad de las sustancias, antioxidantes conlleva, al estrés, oxidativo, produciendo daño, celular (56) . En el sistema, de pruebas, la evaluación, de la actividad, antioxidante se enfoca, en monitorear, la capacidad del, extracto para capturar, radicales libres o inhibir, su formación (57) . El estrés, oxidativo es un desequilibrio, entre los antioxidantes, y los oxígenos, llevando a cabo, el daño celular, por lo que, se ha relacionado, con el asma, el cáncer, cataratas, diabetes, inflamación gastrointestinal enfermedad, hepática, envejecimiento, aterosclerosis, lesión isquémica y enfermedades, neurodegenerativas como el Parkinson, y Alzheimer (58) . Dentro, de las fuentes de, sustancias oxidantes, tenemos dos grupos: Endógenas: El citocromo p450, citocromo b5, catecolaminas, riboflavina, mieloperoxidasa, y la NADPH-oxidasa. Se ha demostrado que los radicales libres cumplen funciones fisiológicas importantes 22 en nuestro organismo (59) . Exógenas: Xenobioticos, (benzopirenos, quinonas, bipirilidos), el humo del cigarro, ciertos componentes de la dieta (sales de hierro y cobre), las radiaciones y la hiperoxia. Las características de un radical libre son (60) :  Electrón no apareado.  Alta inestabilidad. Las situaciones que aumentan la producción de radicales libres son:  Humo de cigarro.  Procesos metabólicos.  Las dietas ricas en grasas.  Drogas.  Contaminación ambiental, etc. 1.1.7. Estrés oxidativo A pesar que el oxígeno, se puede encontrar en su, forma estable (O2), existen acciones, enzimáticas, reacciones químicas o, efectos de las radiaciones, ionizantes que logran, generar radicales, libres, capaces de generar, un daño, celular, daño a las, macromoléculas, entre, otros (61) . En los orbitales, los electrones se mantienen apareados con un espín particular, cuando se tienen electrones desapareados se pierde la estabilidad, ganando reactividad la molécula, ya que dichos electrones tratarán de robar electrones de otras moléculas para estabilizarse. Las especies reactivas de oxigeno (ROS) pertenecen a este tipo de moléculas conocidas por ser precursores de radicales o también llamados radicales libres (RL). El principal radical libre es el oxígeno y es debido a que posee dos electrones desapareados (62) . Entre los radicales libres más conocidos podemos encontrar a los superóxidos (O2 -), hidróxidos (OH-) y especies oxigenadas como peróxidos (H2O2) (63) . Los radicales libres, pueden ser de origen, endógeno (cadena respiratoria, auto oxidación, de compuestos, de carbono, etc) o exógenos, (contaminación, ambiental, humo, drogas, entre otras) (64) . Como respuesta, al daño que se genera, nuestro organismo, se defiende con, ayuda de moléculas, antioxidantes, para evitar, que se genere, un proceso, llamado estrés, oxidativo (65) . 23 TABLA 2. Fuentes comunes de radicales libres y fuentes comunes de antioxidantes. Fuente: Environmental Health Science Core Center – University of Michigan 1.1.8. Envejecimiento y patologías Uno de los, factores principales, del envejecimiento, se debe a la, presencia de los radicales, libres, debido a que, los radicales, libres pueden, superar las defensas, antioxidantes, debido a, un aporte insuficiente, en la dieta, de antioxidantes, durante el metabolismo, de fármacos, o por una, activación excesiva, del sistema celular (66) . Los radicales, libres se pueden, encontrar en el interior, o exterior, de las células, pero a la vez, podrían encontrarse, diseminados por, todo el organismo, pudiendo dañar, principalmente al tejido, conjuntivo, lípidos, proteínas, encimas, fibras de colágeno, ADN y ARN. A la vez los, radicales libres son uno, de los responsables de, enfermedades degenerativas, como el cáncer, enfermedades cardiovasculares, y cerebrovasculares (67) . 1.1.9. Polifenoles Los compuestos, fenólicos son metabolitos, secundarios presentes, en hojas, flores, semillas, vegetales y cortezas. Son hidrosolubles, y poseen un anillo, aromático en común, con uno, o más sustituyentes, de hidroxilos, pueden, estar combinados, con una molécula de azúcar como glucósido (68) . Los polifenoles, ayudan en gran, medida con el color, textura y, sabor de los, alimentos. Son a la vez, sintetizados en respuesta, al ataque de insectos, bacterias, virus y hongos (69) . Los fenoles son, considerados metabolitos, secundarios, nacen, del metabolismo, de las plantas, por medio, de dos vías, principales: La ruta del ácido, acético y del, ácido shikímico (70) . Tienen, participación en, la actividad, enzimática, la fotosíntesis, defensa ante 24 factores, adversos del ambiente, entre otros. Los podemos, encontrar en, las frutas, verduras, frutos secos, vino, café, té, café, etc. Los niveles, del compuesto, dependerán, de los factores genéticos, y ambientales, que determinen, la germinación, el crecimiento y calidad de los cultivos (71) . Los principalmente, efectos, beneficiosos se deben, por las propiedades, antioxidantes (72) , antiinflamatorias (73) y anticancerígenas (74) que presentaban, los polifenoles. 1.1.9.1. Actividad antioxidante de los compuestos fenólicos A lo largo, del tiempo, los compuestos, fenólicos han, sido atribuidos, de varios, beneficios, y diversos, estudios han, recomendado el consumo, de verduras, y frutas para reducir, enfermedades cardiovasculares, y de cáncer, por las propiedades, antioxidantes (75) . Por lo que, los polifenoles podrían, ayudar a prevenir, la la mutación, del DNA, oxidación lipídica, y el daño del tejido. Figura 06. Consecuencias de las ERO en enfermedades y el papel preventivo de los polifenoles. Fuente: Shahidi y Naczk (2004) La actividad, antioxidante de los, compuestos fenólicos, parece guardar relación, con la capacidad, de captar radicales, libres, inhibir la, lipoxigenasa y quelar, metales (76) . 25 1.1.10. Flavonoides Los flavonoides, son pigmentos, vegetales que tienen, un esqueleto, de carbono, C6 - C3 - C6. Los flavonoides, están compuestos, por 2 anillos aromáticos, (A y B), que esta, unidos por una, cadena de tres, átomos de carbono, (C) (77) , están ampliamente, distribuido entre, las plantas, constituyendo, la mayoría de los, colores amarillo, rojo y, azul de las, plantas, y frutas (78) . Pinelo (79) , menciona que la mayoría de flavonoides tienen la terminación INA u OL. Estos nombres fueron asignados por los investigadores que los descubrieron en la naturaleza. A la combinación, núcleo flavonoide, básico más una o, varias unidades de carbohidratos, se les denomina, glicósidos, y cuando no, tienen ligadas moléculas de, carbohidratos se las denomina, agliconas flavonoides (80) . Figura 07. Estructura principal de flavonoides Fuente: Shahidi y Naczk (1995) Con la estructura básica permite una multitud de variaciones y sustituciones en el anillo pirona dando lugar a catequinas, flavonoles, chalconas, isoflavonoides, antocianidinas dihidrochalconas, leucoantocianidinas o taninos condensados. Las flavonas, los flavonoles y sus glicósidos son los compuestos más abundantes (81) . 1.1.10.1. Clasificación de los flavonoides Moreno (82) , Menciona que, en función de sus características, estructurales se pueden, clasificar en: - Flavanos (ejm: catequina) - Flavonoles (ejm: quercitina) - Flavonas (ejm: diosmetina) - Antocianidinas - Calconas - Isoflavonoides 26 Figura 08. Flavonoides, estructura básica y tipos. Fuente: Flavonoides en alimentos vegetales: estructura y actividad antioxidante (2002) 1.1.10.2. Cuantificación de flavonoides totales Para poder identificar los flavonoides, se pueden utilizar reacciones de coloración; como las que utilizan tricloruro de azufre, tricloruro de aluminio y tricloruro de hierro; estas reacciones forman complejos que presentan absorbancia en el espectro UV pudiendo ser identificadas mediante la técnica de espectrofotometría UV-visible. También existen otras reacciones de color específicas para poder determinar el tipo de flavonoide al que pertenece y reacciones de color para comprobar la existencia de sustituyentes en la posición orto (83) . 1.1.11. Métodos de evaluación de la actividad antioxidante Actualmente para determinar la actividad antioxidante, existen varios métodos basados en su capacidad para captar radicales libres. Entre los cuales, podemos mencional el uso del 2,2-difenil -1-picril hidrazilo (DPPH), ácido 2,2´, azinobis (3 - etilbenzotiazolin) - 6- sulfónico (ABTS), la reacción con el óxido nitroso, dicloridrato de N, N-Dimetilpfenilendiamina (DMPD), generación de radicales peróxilo, superóxido e hidroxilo, y otros. (84, 85, 86, 87, 88, 89) . 1.1.11.1. Método del DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidracil) Este ensayo, es uno de los, más conocidos, para el estudio de, antioxidantes, naturales, debido a su, simplicidad y alta, sensibilidad (Brand-Williams) (90) . El DPPH+ (radical con, un electrón, desapareado de, color azul-violeta) acepta, un hidrógeno, del antioxidante, para formar, DPPH, decolorándose hacia, amarillo pálido. Para cuantificar, el contenido, se realiza por, espectroscopía de, UV/VIS, a una absorbancia, de 517 nm. Los resultados, se expresan como, TEAC. Se 27 realizará, el método, descrito por: Brand-Williams W, con algunas, modificaciones (90) . Figura 09. Método de captación del radical 2,2-difenil-1-picril-hidrazilo (DPPH). La actividad antioxidante de una muestra se expresa en IC50 (concentración mínima necesaria para inhibir al 50% el (DPPH). Fuente: CHIMACTIV – Determination of the activity of an antioxidant by the DPPH 1.1.12. Toxicidad Aquella, sustancia exógena, que reacciona, con las moléculas, endógenas del, organismo, causando, daños temporales, o permanentes, de los tejidos. La potencialidad, tóxica dependerá, de la dosis, administrada, mientras menor, sea la dosis, para producir, el efecto nocivo, mayor, será la potencialidad, tóxica (91) . Para determinar el peligro, potencial del agente, químico, se utilizan animales, de experimentación donde, son expuestos a, dosis únicas, para determinar, la toxicidad aguda, o a dosis repetidas, para la, determinación de la toxicidad, subaguda, subcrónica y, crónica (92) , en la cual, se evalua, la mortalidad, incidencia, de signos, tóxicos, consumo de, alimentos y, peso corporal. Los daños, fisiológicos pueden, ser reversibles o, irreversibles (93) . 1.1.12.1. Parámetros que se utilizan para determinar la toxicidad A) Toxicidad aguda Presentan, signos, síntomas, y efectos adversos, manifestados, en segundos, minutos, horas o días (14 días máximo), luego, de una administración, por via oral, o cutánea de, una dosis elevada, del agente, químico. A la vez, se puede realizar, otros estudios, como la, administración de dosis, multiples a lo largo, de 24 horas (DL50) o inhalación, durante cuatro horas, (CL50) (ver TABLA 3) (91)(92)(94) . 28 TABLA 3. Escala de rangos, grados o estimaciones de toxicidad aguda (ETA) en función a la DL50 de la sustancia diseñado por John William Trevan (91)(92)(94)(95) B) Toxicidad crónica Presencia de síntomas clínicos, durante largo tiempo, que pueden durar unos días o un año o más, tras exposiciones repetidas a una sustancia potencialmente tóxica (92)(94)(95) . 1.1.12.2. Dosis letal media (DL50) Es una, dosis de sustancia, que produce, la muerte del, 50% de los, animales de, experimentación, en la cual, son observados, (para revisar, los síntomas, signos, hallazgos patológicos, y efectos tóxicos); durante 14, días después, de la administración, de la sustancia (91)(92)(94) . 1.1.12.3. Bases legales 1) Normas nacionales La ley General, de Salud (96) Nº 26842, en el ítem XV, del título, preliminar establece, que el estado, promueve la investigación, científica y, tecnológica enfocada, en la salud del, ser humano. 2) Normas internacionales En el comentario VI, del texto Pautas, Éticas de Investigación, en Sujetos Humanos: Nuevas, perspectivas del, programa regional, de bioética, de la OPS/OMS, indica que se debe, establecer pautas, para cuidar, el medio ambiente, y el bienestar, de los animales, de experimentación utilizados (97) . RANGO GRADOS DE TOXICIDAD DL50 RATA, VÍA ORAL, DOSIS ÚNICA mg/Kg g/Kg 1. Extremadamente tóxico < 1 2. Altamente tóxico 1 – 50 3. Moderadamente tóxico 50 – 500 4. Ligeramente tóxico 500 – 5000 0,5 – 5 5. Prácticamente no tóxico 5000 – 15 000 5 – 15 6. Relativamente inocuo > 15 000 > 15 29 1.2. Marco Conceptual Fitoquímicos: Serie de, compuestos bioactivos, que no tienen, valor nutricional, encontrados, en las plantas. Screening fitoquimico: consiste en la extracción de metabolitos secundarios con los solventes apropiados y la aplicación de reacciones de coloración. Metabolitos secundarios: Aquellos compuestos, orgánicos en la cual, no desempeñan un, rol directo en el crecimiento, y reproducción del, mismo, pero importantes, por sus diversas propiedades, farmacológicas. Flavonoides: Son metabolitos, secundarios presentes, en diversas frutas, verduras y especias. Capacidad Antioxidante: Es la capacidad que tiene una sustancia antioxidante para disminuir la presencia de la especie reactiva de oxigeno antes de reaccionar con diversos sustratos (lípidos, proteínas, ADN) DPPH: Compuesto, orgánico químico, 2,2-difenil-1-picrilhidrazil, utilizado para determinar, la capacidad antioxidante de un, compuesto determinado. Radicales libres: Son moléculas que, contienen un electrón, no apareado, pudiendo causar, un daño oxidativo, desde células, hasta tejidos. 30 II. ESTRATEGIA METODOLÓGICA 2.1. Tipo, Nivel y Diseño de la Investigación 2.1.1. Tipo de investigación: Básica Son los conocimientos basicos con el fin de incrementar los principios fundamentales de la naturaleza. En esta investigación se obtuvo conocimientos basicos relacionados a metabolitos secundarios, actividad antioxidante y toxicidad. 2.1.2. Nivel de investigación: Descriptivo- Explicativo Descriptivo: Es examinar características del problema escogido. Explicativo: Se encarga de buscar el porque de los hechos. En el presente trabajo se establecio la posible relacion que tendrian los metabolitos secundarios hallados y la actividad antioxidante y la toxicidad aguda. 2.1.3. Diseño de la investigación: Experimental Es aquella donde el investigador manipula una variable y controla o aleatoriza el resto de variables. Se cuenta con un grupo control y los sujetos que han sido asignados al azar entre los grupos. 2.2. Población y Muestra 2.2.1. Material Botanico Población: La planta Helenium aromaticum (Hook.) L.H. Bailey “Manzanilla Macho” se recolectará en el Departamento de Ica, provincia de Ica, distrito de yauca en la zona de Molletambo. Muestra: Se recolectará la parte aérea de Helenium aromaticum (Hook.) L.H. Bailey “Manzanilla Macho” 2.2.2. Material biológico Población: Ratones albinos hembras Muestra: Ratones albinos hembras cepa balb/c, del Instituto Nacional de Salud, con peso de 25 ± 5 g. 2.3. Técnicas y procesamiento de recolección de datos La especie vegetal H. aromaticum, (Hook.) L.H. Bailey fue recolectada, por el autor en la, zona de Molletambo, distrito de Yauca, del Rosario, región y departamento, de Ica; en los puntos de georreferenciación, (GPS): latitud (S): 14°11'1.73", longitud (W): 75°22'47.28", en los meses, de abril 2017 - Junio 2017. La zona, de recolección, fue delimitada a un, área no mayor de 120m2, dividida, en cuadrantes, pequeños. La recolección se realizó, por la mañana, utilizando, unas tijeras de podar y utilizando, bolsas de papel kraft para, transportarlas a la Facultad, de Farmacia y Bioquímica, de la Universidad Nacional San Luis Gonzaga de Ica. 31 Figura 10. Zona de Molletambo distrito de Yauca del Rosario - Ica 2.4. Técnicas de procesamiento de la información. 2.4.1. Tratamiento de la muestra El tratamiento de la muestra se realizó el secado de la muestra vegetal en un lugar seco, al aire libre y en ausencia de los rayos, solares por 21 días, tomando una muestra representativa para su, clasificación taxonómica, realizada por el Blgo. Alfonso Orellana García (Ver anexo, Fig.12). Luego se, realizó la selección de la parte aérea del H. aromaticum, que se encontraba en buen estado (98)(99)(100) . 2.4.2. Ensayo Fitoquímico 2.4.2.1. Obtencion del extracto etanólico 7 kg de la parte aérea, de H. aromaticum, secas y molidas, se sometieron a reflujo por un tiempo, de 4 horas hasta agotamiento con, etanol de 96°, se filtró en caliente y, posteriormente se concentró, en un rotavapor modelo HEIDOLPH LABORATORA, 4000 hasta sequedad. Se obtuvo, 250 g de extracto seco de color, marrón oscuro (101) (Ver anexo, Fig. 15). 2.4.2.2. Screening fitoquímico: Las reacciones, de coloración y/o precipitación, servirán para el reconocimiento, de los metabolitos, secundarios. La obtención de fracciones y la identificación de metabolitos secundarios se realizaron de acuerdo al libro “Investigación Fitoquímica. Métodos en el estudio de productos naturales” del Autor: Olga Lock Sing, indicado en el anexo (99)(100) . 32 2.4.3. Prueba de Toxicidad Aguda Oral El ensayo fue conducido según el método de las clases tóxicas agudas descrito en la normativa Nº 423 de la OECD (OECD Guideline For Testing of Chemical «Acute Oral Toxicity Acute Toxic Class Method» Nº 423 Adoptada, 20 de diciembre, 2001). Se realizó de acuerdo al principio de la prueba límite a 2000 mg/Kg por vía oral para sustancias con baja toxicidad. Se realizó en 18 ratones, hembras de 15 – 24 g de peso. Previamente se pesaron los ratones y aleatoriamente se conformaron 2 grupos de 9 ratones cada uno, un grupo se le administró el extracto a la dosis de 2000 mg/Kg y el otro grupo de 9 ratones, solo se administró el vehículo (grupo control). Los animales se mantuvieron en ayunas durante la noche antes del experimento y bajo condiciones estándar. Se procedió a administrar el extracto a la dosis mencionada disuelto en una solución de Tween al 5% en un, volumen de 100 mg/mL en forma secuencial, cada 24 horas. Se observaron, los animales experimentales, para detectar algún, cambio en su peso (inicio, 7, y 14 días), y la mortalidad por un período de 14 días después del tratamiento (103). La atención se dirigió a la observación de temblores, convulsiones, salivación, diarrea, letargo, sueño y coma. Al concluir el período experimental se sacrificaron a los animales, y se realizó un examen macroscópico de órganos y tejidos (corazón, riñón, pulmón, hígado, bazo, estómago). 2.4.4. Determinación de la actividad antioxidante Para cuantificar la capacidad captadora de radicales libres de los extractos, se determinaron por grado de decoloración que provocan sus componentes a una solución metanólica de DPPH mediante el método de Brand-Williams, con algunas modificaciones. Se realizó el control positivo con ácido ascórbico. Se preparó una solución madre de DPPH aproximadamente 30mg/L del radical en metanol cuya absorbancia debe estar entre 0.9 a 1.1, 2.9 mL de esta solución se mezclan con 100μL de cada extracto a concentraciones diferentes. Se preparó un blanco de referencia con 2.9 mL DPPH y 100μL de solvente. Se incubó a una temperatura ambiente durante 30 minutos en la oscuridad y se midió la absorbancia a 517nm en un espectrofotómetro en el rango visible (90) . Los experimentos se llevaron a cabo usando un bloque de diseño al azar, por triplicado. La actividad antioxidante se expresó como porcentaje de inhibición lo cual corresponde a la cantidad de radical DPPH neutralizado por el extracto a una determinada concentración, de acuerdo a la siguiente ecuación, para posteriormente hallar su IC50. Y su respectivo equivalente como ácido ascórbico. 33 2.5. ASPECTOS ÉTICOS El manejo de animales de experimentación se realizó según “International Guiding Principles for Biomedical Research Involving Animals (103). 34 III. RESULTADOS TABLA 4. Metabolitos secundarios presentes en el extracto etanólico de la parte aérea de Helenium aromaticum (Hook.) L.H. Bailey “Manzanilla macho” Fracciones Metabolitos Reacciones Resultados A Flavonoides Rx. de Shinoda + Aminoácidos Rx. de Nihidrina + Taninos Rx. de Gelatina - Rx. de Cloruro férrico + B Triterpenoides y/o esteroides Rx. de Lieberman Burchard + Flavonoides Rx. de Shinoda + Quinonas Rx. de Borntrager - C Triterpenoides y/o esteroides Rx. de Lieberman Burchard + Lactonas sesquiterpénicas Rx. de Kedde + Alcaloides Rx. de Mayer + Rx. de Munier + Rx. de Dragendorf + D Flavonoides Rx. de Shinoda + Catequinas Rx. de Rosenheim + Triterpenoides y/o esteroides Rx. de Lieberman Burchard + Alcaloides Rx. de Mayer + Rx. de Munier + Rx. de Dragendorf + Rx. Wagner + E Flavonoides Rx. de Shinoda + Catequinas Rx. de Rosenheim + A: Extracto etanólico total D: fracción diclorometanica – etanólica B: Fracción insoluble E: fracción acuosa remanente C: Fracción diclorometanica (-): Ausencia (+): Presencia| 35 Figura 11. Capacidad antioxidante de las Fracciones obtenidas a partir del extracto etanólico de la parte aérea de Helenium aromaticum (Hook.) L.H. Bailey “Manzanilla macho” mediante el método de DPPH. En la Figura 11 se observa el rendimiento de cada una de las fracciones analizadas, así mismo, la fracción A presento un IC50 = 3.049, la fracción C un IC50 = 9.945, la fracción D un IC50 = 0.462, la fracción E un IC50 = 2.673. 36 TABLA 5. Resultados de la prueba de toxicidad aguda del extracto etanólico de la parte aérea de Helenium aromaticum (Hook.) L.H. Bailey “Manzanilla macho”. Grupo Control Grupo tratado 2000 mg/Kg Observación Mortalidad Todos sobrevivieron Todos murieron Debió replantearse a la dosis de 1500 mg/Kg, pero por motivos económicos y de logística no se pudo realizar (La pandemia no lo permitió). Estudio macroscópico de principales órganos Sin cambios significativos Se observó un cambio significativo con respecto a los órganos del grupo control en el tamaño y color. - Peso corporal promedio (g) 22.08 g (± 0.62) No se pudo evaluar debido a que los ratones murieron en un lapso promedio de 2 horas - Signos y síntomas Temblores No presenta Si presenta - Convulsiones No presenta Si presenta Micción No presenta Si presenta Defecación No presenta Si presenta Letargo No presenta Si presenta 37 IV. DISCUSION Los resultados obtenidos por el método del DPPH indican que la Fracción D del extracto etanólico de la parte aérea de Helenium aromaticum (Hook.) L.H. Bailey mostró un valor IC50 mayor (IC50 de 0,462mg/mL) que de la Fracción C (IC50 9,945 mg/mL) para inhibir el radical DPPH, siendo la Fraccion D del extracto etanólico de la parte aérea de Helenium aromaticum (Hook.) L.H. Bailey, la fracción que presentó mayor actividad antioxidante. Dicha capacidad antioxidante se atribuiría al alto contenido de Flavonoides, Taninos (Catequinas), triterpenos y/o esteroides y alcaloides totales que presenta, esto de acuerdo con estudios previos que indican una relación directa entre actividad antioxidante y el contenido de taninos y su eficiencia antirradical. (116) (117) En cuanto al potencial toxicológico del extracto etanólico de la parte aérea de Helenium aromaticum (Hook.) L.H. Bailey, se ha observado que la dosis letal media estaría por debajo de 2000 mg/Kg de peso, debió replantearse a dosis de 1500 mg/Kg, pero no se pudo realizar por motivos económicos y de carencia de animales de experimentación debido a que la pandemia no lo permitió, lo que implica realizar estudios de toxicidad aguda a dosis menores y así estimar el nivel de toxicidad aguda. De acuerdo a la composición química del extracto, el potencial tóxico se debería a la presencia de lactonas sesquiterpenicas del extracto total administradas en los ratones, para lo cual, se cree que los grupos α-metilen- γ-lactonas, grupos ciclopentenonas α, β-insaturadas y grupos epoxi presentes en las lactonas sesquiterpénicas pueden influir en su actividad. El grupo α, ß insaturado, puede reaccionar con grupos, sulfihidrilos, encontrados, en las enzimas y, proteínas, originando efectos, tóxicos. Pudiendo considerar, a las lactonas, sesquiterpénicas, como moléculas, interesantes para, la medicina, pero a la vez, tóxicas (104). Investigaciones afines, consideraron en un principio a las lactonas sesquiterpénicas como muy citotóxicas, pero las modificaciones químicas introducidas en estas moléculas han incrementado sus actividades farmacológicas (antimicrobiana, antitumoral, antiinflamatoria, antioxidante, antiulcerogénica, antihelmíntica, hepatoprotectora, antiprotozoaria y antidepresiva) y han disminuido su citotoxicidad, de modo que han atraído la atención como moléculas líderes. Es por ello, que los estudios fitoquimicos, farmacológicos y toxicológicos del extracto etanólico de la parte aérea de Helenium aromaticum (Hook.) L.H. Bailey deben profundizarse para poder así ser empleados como prototipos para el desarrollo de nuevas drogas útiles a la terapéutica, como el cáncer. 38 V. CONCLUSIONES 1. Los metabolitos secundarios encontrados en el Screening Fitoquímico del extracto etanólico de la parte aérea de Helenium aromaticum (Hook.) L.H. Bailey “Manzanilla macho” fueron: Fracción A (Flavonoides, Aminoácidos, Taninos), Fracción B (Triterpenoides y/o esteroides, Flavonoides, Quinonas), Fracción C (Triterpenoides y/o esteroides, Lactonas sesquiterpénicas, Alcaloides), Fracción D (Flavonoides, Catequinas, Triterpenoides y/o esteroides, Alcaloides) y la Fracción E (Flavonoides, Catequinas). 2. Las fracciones del extracto etanólico de la parte aérea de Helenium aromaticum (Hook.) L.H. Bailey “Manzanilla macho” presentaron una buena actividad Antioxidante, siendo la Fracción D la que presento una mayor actividad, con un IC50 de 0.462 mg/mL. 3. En el extracto etanólico de la parte aérea de Helenium aromaticum (Hook.) L.H. Bailey “Manzanilla macho” presentó características tóxicas agudas a dosis de 2000 mg/Kg. 39 VI. RECOMENDACIONES 1. Continuar con el estudio antioxidante probando otros métodos en las diferentes fracciones del extracto etanólico de la parte aérea de Helenium aromaticum (Hook.) L.H. Bailey “Manzanilla macho”. 2. Realizar diferentes extractos de Helenium aromaticum (Hook.) L.H. Bailey “Manzanilla macho” utilizando otros solventes de distinta polaridad. 3. Realizar estudios de toxicidad aguda a la dosis de 1500 mg/Kg y 1000 mg/Kg de peso, del extracto etanólico de la parte aérea de Helenium aromaticum (Hook.) L.H. Bailey “Manzanilla macho”. 4. Comparar la actividad antioxidante entre un fármaco antioxidante de elección y la fracción que presentó mayor actividad antioxidante del extracto etanólico de la parte aérea de Helenium aromaticum (Hook.) L.H. Bailey “Manzanilla macho”. 40 VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Cardoso L., Silva S, Castro-Gamboa I., Bolzani S. New Biflavonoid and Other Flavonoids from the Leaves of Chimarrhis turbinata and their Antioxidant Activity. Journal of Brazilian Chemical Society; (2005) 16: 1353- 1359. 2. Carocho, M. & Ferreira, I. 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Rosario/Ica), “manzanilla de campo” o “manzanilla de cerro” (Valparaíso/Chile). c) Sinónimos (31) Cephalophora aromatica (Hook.) Schrad. Cephalophora collina Phil. Cephalophora lanceolata Phil. Cephalophora tenera Cass. Gaillardia aromatica Baill. d) Descripción de la especie Es una hierba, hasta de 0,60m de altura, erecto, y poca ramificada, basalmente, formando una, cobertura de, hasta 30 cm. Tallo delgado, verde amarillento, semi-pubescente. Hojas, lanceoladas de, borde ligeramente dentado, en la parte, superior de, la planta y, hojas basales, en mayor número, lanceoladas-espatuladas de, borde más, sinuoso y, dentado (a lobulado). Hojas, alternas, sésiles, de color, verde claro y, con nervadura central, notoria en el, haz de coloración, blanquecina. Flores, pequeñas de color, Amarillo, limón de olor, característico agradable, similar a, manzanilla (Matricaria chamomilla L.), dispuestas, en cabezuelas, totalmente esféricas, terminales y compactas, de aproximadamente, 10-14 mm, de diámetro. Sus frutos, son pequeños, a manera, de conos, invertidos, con la base, negruzca y ápice, blanquecino, de 2-3m, largo. Hábitat en, zonas de escorrentía, de huaycos y, ribereños con humedad, esporádica, en suelos arenosos y, arcillosos. e) Distribución Helenium es, un género nativo, de Norteamérica, y Centroamérica. Comprende, 208 especies, descritas y de, estas, solo 39 aceptadas (32). H. aromaticum es, una especie que, en el Perú se, distribuye en, Arequipa, Ayacucho, Lima e Ica (33, 34). f) Usos Planta de valor medicinal, de nulo valor ornamental. En infusión y extracto se usa como febrífugo (35). 51 Figura 13. Recolección y Pre- Selección de la planta Helenium aromaticum “Manzanilla macho” 52 Figura 14. Flujograma del tratamiento de la muestra vegetal de la parte aérea de H. aromaticum (Hook.) L.H. Bailey. 53 Figura 15. Flujograma de la obtención del extracto etanólico de la parte aérea de H. aromaticum (Hook.) L.H. Bailey. Mediante el método de maceración PESAR LA PLANTA SECA Y MOLIDA OBTENCION DEL EXTRACTO ETANOLICO SECO CONCENTRAR EL EXTRACTO ETANÓLICO EN UN ROTAVAPOR HASTA SEQUEDAD FILTRADO AMACERAR LA PLANTA CON ETANOL DE 96° 54 A. Obtención de Fracciones: A partir de 250 g de extracto etanólico seco, se realizó el fraccionamiento por extracción con disolventes orgánicos de diferente polaridad que facilitan la separación de los metabolitos secundarios. Se realizó el siguiente procedimiento:  Se separó 10 g de la muestra, formando así la fracción “A”.  Al resto de la muestra, se agregó 350 mL de HCl al 1%, se filtró y se obtuvo 2 partes, a la muestra restante se le agregó 350 mL de HCl al 1%, se filtró y se obtuvo 2 partes, una insoluble que lavándola con agua destilada se obtendría un pH neutro, para posteriormente filtrarlo y dejarlo secar a temperatura ambiente, para luego ser disuelto en 100 mL de diclorometano, formando así, la fracción “B”.  La parte soluble ácida se neutralizó con 7 mL de hidróxido de amonio al 25%, hasta pH 11, se colocó la solución en una pera de bromo y se agregó porciones de 100 mL de diclorometano, se agitó fuertemente formando dos fases, en la cual, se colectó la fase diclorometánica; repitiendo esta operación por triplicado, la cual, luego se dejó secar la fase diclorometano a temperatura ambiente, formando así, la fracción “C”.  A la fase acuosa se agregó 100 mL de diclorometano-etanol en la proporción 3:4, se agitó y dejó separar la fase orgánica de la acuosa, luego se colectó la fase diclorometánica-etanólica, repitiéndose esta operación 8 veces; se filtró, formando así, la fracción “D”.  La solución acuosa restante se secó a temperatura ambiente, formando asi, la fracción “E”. B. Identificación de metabolitos secundarios Se realizaron los siguientes ensayos de identificación de metabolitos secundarios. a) Detección de taninos:  Reacción de cloruro férrico: En un tubo de ensayo se colocó 0,5 mL de la fracción “A” y se agregó una gota de solución acuosa de FeCl3 1%. La reacción es positiva cuando la torna de un color azul-negro, verde o azul verdoso.  Reacción de gelatina-sal: Se agregó 0,5 mL de extracto de la fracción “A” sobre 5 mL de solución de NaCl 5%, gelatina 1% y gelatina-sal, la precipitación con este último reactivo o con ambos el 1º y 2º es indicativo de la presencia de taninos, si solamente ocurre con el 1º, podría ser un falso positivo. b) Detección de aminoácidos:  Reacción de ninhidrina: Sobre tiras de papel de filtro se colocó con un capilar:  Una gota de fracción “A” más una gota del reactivo de ninhidrina. 55  Blanco: Una gota de solución etanólica de ninhidrina al 2%.  Testigo: Una gota de solución de metionina 5%. Luego del secado a temperatura ambiente las tiras de papel se colocaron en la estufa a 110-120ºC hasta la aparición de un color en el blanco. Se comparó con la mancha azul violácea de la solución testigo. La reacción es positiva si el papel de la muestra torna de un color azul violáceo. c) Detección de flavonoides:  Reacción de Shinoda: En una placa se agregó 1 mL de la fracción “A” disuelta en etanol, limaduras de Mg y 0,5 mL de HCl concentrado. La reacción es positiva cuando torna de un color rojo, anaranjado y violeta. d) Detección de triterpenoides y/o esteroides:  Reacción de Lieberman Burchard: Sobre 1 mL de la fracción “B” disuelta en diclorometano, se vertió 5 gotas de ácido acético y 1 mL de anhídrido acético. La reacción es positiva si torna de un color verde, azul verdoso (vía rojo o azul). e) Detección de antraquinonas:  Reacción de Borntrager: A 5 mL de la fracción “B” disuelta en diclorometano, se agregó 5 mL de NaOH 5% y se agitó suavemente. La reacción es positiva si la fase acuosa torna un color rojo. f) Detención de lactonas sesquiterpénicas:  Reacción de kedde: Se utilizó dos soluciones; a: ácido 3,5-dinitrobenzoico 2% disuelto en metanol. b: Hidróxido de potasio 5,7% disuelto en agua. Se mezcló las soluciones a + b, en volúmenes iguales esto constituye el reactivo (R). Se colocó en un tubo de ensayo 1 mg de la fracción “C” + 2 gotas del reactivo. Si la reacción es positiva se torna un color púrpura o violáceo. g) Detección de alcaloides: Se evaporó la fracción “C” hasta sequedad, luego se agregó 2 mL de HCl 1% y se filtró. Se realizó las reacciones de precipitación de Dragendorf, Mayer y Munier. La reacción es positiva si aparece un precipitado. h) Detección de leucoantocianidinas y catequinas:  Reacción de Rosenheim: A 0,2 mL de la fracción “D” se agregó 0,1 mL de HCl concentrado, luego se calentó durante 10 minutos a 100 ºC, se dejó enfriar y se adicionó 2 mL de agua y 0,4 mL de alcohol amílico, agitar y observar el color en la fase amílica. La reacción se considera positiva si torna un color que va desde el rosado débil hasta carmesí oscuro. Si es rojo indica presencia de antocianidinas. Si es marrón indica presencia de catequinas (Ver anexo, Fig. 16, 17, 18, 19, 20, 21 y 22). 56 Figura 16. Flujograma del fraccionamiento del extracto etanólico de la parte aérea de H. aromaticum (Hook.) L.H. Bailey. 57 Figura 17. Flujograma del Screening Fitoquímico 58 FRACCION “A” Figura 18. Identificación de los metabolitos secundarios de la fracción “A” del extracto etanólico de la parte aérea de H. aromaticum (Hook.) L.H. Bailey. 59 FRACCION “B” Figura 19. Identificación de los metabolitos secundarios de la fraccion “B” del extracto etanólico de la parte aérea de H. aromaticum (Hook.) L.H. Bailey. 60 FRACCION “C” Figura 20. Identificación de los metabolitos secundarios de la fraccion “C” del extracto etanólico de la parte aérea de H. aromaticum (Hook.) L.H. Bailey. 61 FRACCION “D” Figura 21. Identificación de los metabolitos secundarios de la fraccion “D” del extracto etanólico de la parte aérea de H. aromaticum (Hook.) L.H. Bailey. 62 FRACCION “E” Figura 22. Identificación de los metabolitos secundarios de la fraccion “E” del extracto etanólico de la parte aérea de H. aromaticum (Hook.) L.H. Bailey. 63 Figura 23. Determinación de la actividad antioxidante de la Fracción D del extracto etanólico de la planta Helenium aromaticum “Manzanilla macho” mediante la decoloración del catión radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH·) . 64 TABLA 6. Porcentaje de inhibición del radical DPPH de la Fracción “A” del extracto etanólico de la parte aérea de helenium aromaticum (hook.) l.h. bailey “manzanilla macho” TABLA 7. Porcentaje de inhibición del radical DPPH de la Fracción “C” del extracto etanólico de la parte aérea de helenium aromaticum (hook.) l.h. bailey “manzanilla macho” Concentración (mg/mL) Absorbancia Blanco Absorbancia final % Inhibición Radical DPPH 3 0.918 0.458 ± 0.013 50.10893246 2.5 0.918 0.535 ± 0.014 41.72113289 2 0.918 0.610 ± 0.011 33.55119825 1.5 0.918 0.686 ± 0.019 25.27233115 1 0.918 0.765 ± 0.010 16.66666666 0.5 0.918 0.843 ± 0.017 8.16993464 Concentración (mg/mL) Absorbancia Blanco Absorbancia final % Inhibición Radical DPPH 4.2 1.040 0.835 ± 0.013 19.71153846 4 1.040 0.845 ± 0.014 18.75000000 3.7 1.040 0.862 ± 0.011 17.11538461 3.5 1.040 0.873 ± 0.019 16.05769230 65 TABLA 8. Porcentaje de inhibición del radical DPPH de la Fracción “D” del extracto etanólico de la parte aérea de helenium aromaticum (hook.) l.h. bailey “manzanilla macho” TABLA 9. Porcentaje de inhibición del radical DPPH de la Fracción “E” del extracto etanólico de la parte aérea de helenium aromaticum (hook.) l.h. bailey “manzanilla macho” Concentración (mg/mL) Absorbancia Blanco Absorbancia final % Inhibición Radical DPPH 3 0.978 0.422 ± 0.013 56.85071574 2.25 0.978 0.575 ± 0.014 41.20654396 1.5 0.978 0.736 ± 0.011 24.74437627 0.75 0.978 0.894 ± 0.019 8.58895705 Concentración (mg/mL) Absorbancia Blanco Absorbancia final % Inhibición Radical DPPH 1.5 0.920 0.085 ± 0.013 90.76086956 0.75 0.920 0.355 ± 0.014 61.41304347 0.45 0.920 0.456 ± 0.011 50.43478260 0.15 0.920 0.578 ± 0.019 37.17391304 0.05 0.920 0.612 ± 0.010 33.47826086 66 OTROS METODOS DE EVALUACIÓN DE ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE A) Método ABTS (Ácido 2,2-Azino-Bis(3-Etilbenzotiazolin)-6- Sulfonico) Este método, se basa e