Reconocimiento-NoComercial 4.0 Internacional Esta licencia permite a otras distribuir, combinar, retocar, y crear a partir de su obra de forma no comercial y, a pesar que son nuevas obras deben siempre rendir crédito y ser no comerciales, no están obligadas a licenciar sus obras derivadas bajo los mismos términos. http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0 http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/ http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0 http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/ UNIVERSIDAD NACIONAL “SAN LUIS GONZAGA” VICERRECTORADO DE INVESTIGACIÓN Facultad de Farmacia y Bioquímica Formulación de un gel cosmético con actividad antioxidante in vitro a partir del extracto hidroalcohólico de Encelia canescens Lamarck “girasol silvestre” Línea de investigación Salud Pública y Conservación del Medio Ambiente INFORME FINAL DE TESIS AUTOR: BACH. GARAY MUÑOZ ROCIO MILAGROS Ica, Perú 2025 ii DEDICATORIA A Dios, por su amor incondicional, por darme la vida y la sabiduría para culminar satisfactoriamente este trabajo de investigación, sin Él nada sería posible. A mi madre, Marisol, por ser mi soporte y mi ejemplo de fortaleza, por acompañarme siempre e inculcarme desde niña que nada es imposible y que puedo alcanzar todo lo que me proponga. A mi padre, Ricardo, por creer en mí, enseñarme a ser constante, luchar siempre por mis ideales y su amor incondicional. A mi hermano, Sergio, por su apoyo constante y sabios consejos, tanto en mi vida personal como profesional. A mi abuela, doña Juana Dora Bernaola de Muñoz, quien me enseñó que siempre existen razones para creer en mí misma y no rendirme ante la adversidad. A mi abuelo, don Juvencio Esaú Muñoz García, quien me enseñó que la honestidad, la ética y la responsabilidad están siempre por encima de cualquier decisión. iii AGREDECIMIENTO Expreso mi especial agradecimiento a mi asesora, Dra. María Dolores Rocío Bendezú Acevedo, por haber sido mi mentora y una guía fundamental en el desarrollo de esta investigación. Le agradezco profundamente su paciencia, la generosidad al compartir sus conocimientos, su apoyo constante ante cada nueva idea orientada a la mejora, así como sus acertados consejos y la motivación permanente que me impulsaron a crecer tanto profesional como personalmente, enseñándome que no existen límites para investigar e inspirándome a explorar y cuestionar siempre con rigor y entusiasmo. Un agradecimiento especial a mis estimados docentes: Dr. Felipe Artemio Surco Laos, cuya paciencia, dedicación, apoyo incondicional y valiosos consejos fueron fundamentales para el desarrollo de esta investigación y a lo largo de mi formación; al Dr. Jorge Antonio García Ceccarelli, por impulsar mi interés en la investigación y motivarme de manera constante en mi crecimiento académico; a la Dra. Santos Haydee Chávez Orellana, por su orientación y acompañamiento durante mi desarrollo académico; y a la Dra. Aura Cabrera Molina, por haberme inspirado, desde el inicio de mi formación profesional, a dar lo mejor de mí. Asimismo, expreso mi gratitud a mi amigo Ricardo Derian Gonzales Vargas, por su apoyo durante esta etapa. A mi alma mater, Universidad Nacional “San Luis Gonzaga”, por brindarme la oportunidad de formarme como profesional y como persona de bien, preparándome para un futuro competitivo. Agradezco profundamente a la Asociación Científica de Investigación Farmacéutica (ACIF), que fue el punto de partida e inspiración para mi deseo de convertirme en investigadora. Un agradecimiento especial a los Químicos Farmacéuticos del Hospital Nacional Edgardo Rebagliati Martins, cuya exigencia constituyó un ejemplo de que el éxito es posible con preparación y determinación. Así mismo, me transmitieron la importancia del trabajo en equipo y del ejercicio de nuestra profesión con ética, recordándome que nuestra hermosa carrera debe estar siempre al servicio y bienestar de la sociedad. iv ÍNDICE ÍNDICE DE TABLAS ................................................................................................................. v ÍNDICE DE FIGURAS ............................................................................................................ viii ÍNDICE DE ANEXOS ............................................................................................................... xi ABREVIATURAS ..................................................................................................................... xii RESUMEN ................................................................................................................................ xiv ABSTRACT ............................................................................................................................... xv I. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................. 16 1.1 Descripción de la realidad problemática ...................................................................... 17 1.2 Formulación del problema ........................................................................................... 17 1.3 Objetivos de la investigación ....................................................................................... 18 1.4 Justificación e importancia .......................................................................................... 18 1.5 Antecedentes de investigación ..................................................................................... 19 1.6 Marco teórico ............................................................................................................... 20 II. ESTRATEGIA METODOLÓGICA ................................................................................ 26 III. RESULTADOS .................................................................................................................. 53 IV. DISCUSIÓN ....................................................................................................................... 97 V. CONCLUSIONES ........................................................................................................... 100 VI. RECOMENDACIONES ................................................................................................. 101 VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................... 102 VIII. ANEXOS ...................................................................................................................... 110 v ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Criterios de inclusión y exclusión de las muestras de Encelia canescens L. "girasol silvestre" ...................................................................................................................................... 27 Tabla 2. Definición de los términos de solubilidad (adaptada de la Farmacopea de los Estados Unidos, Formulario Nacional - USP28/USP38-NF33* y Avisos Generales) y de la Farmacopea Europea, 11.a edición). …………………………………………………………………...……..34 Tabla 3. Evaluación de formulaciones para la selección del agente gelificante………………...43 Tabla 4. Ensayo microbiológico de control de calidad del gel cosmético.………………………47 Tabla 5. Metabolitos secundarios de las fracciones derivadas del extracto hidroalcohólico de las partes aéreas y flores de Encelia canescens L. "girasol silvestre"………………………….….53 Tabla 6. Caracterización organoléptica de los extractos hidroalcohólicos de las partes aéreas y flores de Encelia canescens L. "girasol silvestre"……………………………………………...54 Tabla 7. Caracterización fisicoquímica de los extractos hidroalcohólicos de las partes aéreas de la Encelia canescens L. "girasol silvestre"………………………………………………..……55 Tabla 8. Caracterización fisicoquímica de los extractos hidroalcohólicos de las flores de la Encelia canescens L. "girasol silvestre"………………………………………………..………55 Tabla 9. Ensayo de solubilidad de los extractos hidroalcohólicos obtenidos de la especie Encelia canescens L. "girasol silvestre"……………………………………………………..…..……...56 Tabla 10. Lectura de absorbancia de las disoluciones de patrón de Trolox por el método de CUPRAC………………………………………………………………………………………..57 Tabla 11. Capacidad antioxidante del extracto hidroalcohólico de partes aéreas de Encelia canescens L. "girasol silvestre", mediante el método CUPRAC………………………………..58 Tabla 12. Capacidad antioxidante del extracto hidroalcohólico de flores de Encelia canescens L. "girasol silvestre", mediante el método CUPRAC ……………………………………………...58 Tabla 13. Comparación de medias mediante la prueba de Newman-Keuls para la variable TEAC (α = 0.05), correspondiente a los extractos obtenidos por el método CUPRAC………….……..60 Tabla 14. Lectura de absorbancia de las disoluciones de patrón de Trolox por el método de FRAP……………………………………………………………………………..……………..61 Tabla 15. Capacidad antioxidante del extracto hidroalcohólico de las partes aéreas de Encelia canescens L. "girasol silvestre", mediante el método FRAP….………………………………..62 vi Tabla 16. Capacidad antioxidante del extracto hidroalcohólico de las flores de Encelia canescens L. "girasol silvestre", mediante el método FRAP ………………….……………….…………...62 Tabla 17. Comparación de medias mediante la prueba de Newman-Keuls para la variable TEAC (α = 0.05), correspondiente a los extractos obtenidos por el método FRAP….………….……..64 Tabla 18. Lectura de absorbancia de las disoluciones de patrón de Trolox por el método de ABTS……………………………………………………………………………..……………..65 Tabla 19. Capacidad antioxidante del extracto hidroalcohólico de las partes aéreas de la especie Encelia canescens L. “girasol silvestre”, mediante el método ABTS. …………..……………..66 Tabla 20. Capacidad antioxidante del extracto hidroalcohólico de las flores de la especie Encelia canescens L. “girasol silvestre”, mediante el método ABTS. …………..……………………...66 Tabla 21. Comparación de medias mediante la prueba de Newman-Keuls para la variable TEAC (α = 0.05), correspondiente a los extractos obtenidos por el método ABTS……………………68 Tabla 22. Lectura de absorbancia de las disoluciones de patrón de ácido gálico para la determinación de polifenoles totales….…………………………………………..……………..69 Tabla 23. Determinación de polifenoles totales del extracto hidroalcohólico de flores por método de maceración de Encelia canescens L. "girasol silvestre"…………………………….……….70 Tabla 24. Lectura de absorbancia de las disoluciones de patrón de quercetina para la determinación de flavonoides..…....….…………………………………………..……………..71 Tabla 25. Determinación de flavonoides del extracto hidroalcohólico de flores por método de maceración de Encelia canescens L. "girasol silvestre"………………………….……………..72 Tabla 26. Evaluación de la capacidad antioxidante de las formulaciones del gel cosmético con base B1 del extracto de flores por maceración Encelia canescens L. “girasol silvestre”………..73 Tabla 27. Comparación de medias mediante la prueba de Tukey (α = 0.05) para la variable TEAC (μmol TE/g), correspondiente a las formulaciones con Base 1, por el método CUPRAC……….76 Tabla 28. Evaluación de la capacidad antioxidante de las formulaciones del gel cosmético con base B2 del extracto de flores por maceración Encelia canescens L. “girasol silvestre”………..77 Tabla 29. Comparación de medias mediante la prueba de Tukey (α = 0.05) para la variable TEAC, correspondiente a las formulaciones con Base 2, por el método CUPRAC……………….…….80 Tabla 30. Características organolépticas de la formulación del gel cosmético F4B1 con extracto hidroalcohólico de Encelia canescens L. “girasol silvestre”………………..…………..……..81 vii Tabla 31. Características fisicoquímicas de la formulación del gel cosmético F4B1 con EH de Encelia canescens L. “girasol silvestre”…………………………………………..……………82 Tabla 32. Estudio de estabilidad preliminar del gel antioxidante F4B1 con EH de Encelia canescens L. “girasol silvestre”………………………………………………………………...82 Tabla 33. Control de calidad organoléptico del gel antioxidante F4B1 formulado a partir del EH de flores de Encelia canescens L. “girasol silvestre”…………………………….……………...83 Tabla 34. Control de calidad fisicoquímico del gel antioxidante F4B1 formulado a partir del EH de flores de Encelia canescens L. “girasol silvestre”………………………………………......84 Tabla 35. Control microbiológico del gel antioxidante F4B1 formulado a partir del extracto hidroalcohólico de flores de Encelia canescens L. “girasol silvestre”…………………..……..88 Tabla 36. Curva de cuantificación de Trolox para la determinación de la actividad antioxidante del gel F4B1, por el método FRAP……………………………………………………………...89 Tabla 37. Evaluación de la capacidad antioxidante de la formulación de gel cosmético F4B1 de Encelia canescens L. “girasol silvestre”, por método FRAP……….…………………...……...90 Tabla 38. Lectura de absorbancia de las disoluciones de patrón de Trolox por el método de DPPH……………………………………………………………………………………………91 Tabla 39. Evaluación de la capacidad antioxidante de la formulación de gel cosmético F4B1 de Encelia canescens L. “girasol silvestre”, por método DPPH……………………...-..................92 Tabla 40. Determinación de polifenoles totales de la formulación de gel cosmético de Encelia canescens L. “girasol silvestre”…………….……………………...……………………………93 Tabla 41. Determinación de flavonoides de la formulación de gel cosmético de Encelia canescens L. “girasol silvestre”………………………,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,…..,,,,,,,,,,,,,,,,…………………....94 Tabla 42. Evaluación de la capacidad antioxidante de la formulación de gel antioxidante F4B1 de Encelia canescens L. “girasol silvestre” y del gel antioxidante comercial, por método CUPRAC………………………………………………………………………………………..95 viii ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Fotografía de Encelia canescens Lamarck "girasol silvestre" - Distrito de Rosario de Yauca (Molletambo,Ica)………………………………………………………………………...20 Figura 2. Planta entera de Encelia canescens Lamarck "girasol silvestre"………………...............................................................................................................21 Figura 3. Proceso extractivo………………………….……………………………………..….22 Figura 4. La piel……………………………………………………………………...…………23 Figura 5. Esqueleto carbónico C6-C3-C6, que forma los diversos flavonoides (A), y un flavonol formado a partir de este esqueleto, la quercetina (B)……………………………………………24 Figura 6. Función y vías antienvevjecimiento de los ingredientes derivados de plantas en cosméticos………………………………………………………………………………………25 Figura 7. Ventajas, desventajas y aplicaciones cosméticas de los geles frente a otros sistemas vehiculares………………………………………………………………………………………25 Figura 8. Lugar de la recolección (Molletambo - Ica) ………………………………………….27 Figura 9. Flujograma de la obtención de los extractos hidroalcohólicos ..……………………...29 Figura 10. Flujograma de marcha fitoquímica preliminar para identificar metabolitos……….. 32 Figura 11. Proceso de disolución de la muestra de extracto partes aéreas para el método CUPRAC………………………………………………………………………………………..36 Figura 12. Proceso de disolución de la muestra de extracto partes aéreas para el método FRAP..37 Figura 13. Proceso de disolución de la muestra de extracto partes aéreas para el método ABTS……………………………………………………………………………………………39 Figura 14. Proceso de disolución de la muestra de extracto para determinar polifenoles totales……………………………………………………………………………………………40 Figura 15. Proceso de disolución de la muestra de extracto para determinar flavonoides……….42 Figura 16. Especificaciones microbiológicas…………………………………………………...47 Figura 17. Esquema del procedimiento para el control microbiológico del gel cosmético…….48 Figura 18. Proceso de disolución de la muestra de gel para el método DPPH…………………..50 Figura 19. Curva de cuantificación de Trolox para la determinación de la actividad antioxidante por el método CUPRAC……………………………………………………………………..…..57 Figura 20. Correlación entre las concentraciones del extracto hidroalcohólico de las partes aéreas de Encelia canescens L. "girasol silvestre" y TEAC (mM), por CUPRAC……………………..59 Figura 21. Correlación entre las concentraciones del extracto hidroalcohólico de las flores de Encelia canescens L. "girasol silvestre" y TEAC (mM), por CUPRAC ………………….........59 Figura 22. Representación gráfica de los intervalos de confianza (±EE) de la capacidad antioxidante (TEAC) obtenido por el método CUPRAC para los distintos métodos ….…..…...60 ix Figura 23. Curva de cuantificación de Trolox para la determinación de la actividad antioxidante por el método FRAP……………………………………………………………………………..61 Figura 24. Correlación entre las concentraciones del extracto hidroalcohólico de las partes aéreas de Encelia canescens L. "girasol silvestre" y TEAC (mM), por FRAP ………………….……..63 Figura 25. Correlación entre las concentraciones del extracto hidroalcohólico de las FLOERS de Encelia canescens L. "girasol silvestre" y TEAC (mM), por FRAP ………………….…….…..63 Figura 26. Representación gráfica de los intervalos de confianza (±EE) de la capacidad antioxidante (TEAC) obtenido por el método FRAP para los distintos métodos de extracción…………………………………………………………………………………..…...64 Figura 27. Curva de cuantificación de Trolox para la determinación de la actividad antioxidante por el método ABTS. ……………………………………………………………………….…...65 Figura 28. Correlación entre las concentraciones del extracto hidroalcohólico de las partes aéreas de Encelia canescens L. "girasol silvestre" y TEAC (mM), por ABTS….……………………..67 Figura 29. Correlación entre las concentraciones del extracto hidroalcohólico de las flores de Encelia canescens L. "girasol silvestre" y TEAC (mM), por ABTS….. …………..……….......67 Figura 30. Representación gráfica de los intervalos de confianza (±EE) de la capacidad antioxidante (TEAC) obtenido por el método ABTS para los distintos métodos de extracción…………………………………………………………………………………..…...68 Figura 31. Curva de cuantificación de ácido gálico para la determinación de polifenoles totales…………………………………………………………………………………………....69 Figura 32. Correlación entre concentración del extracto hidroalcohólico de flores de Encelia canescens L. “girasol silvestre” y equivalente de ácido gálico (µg)………..…………………..70 Figura 33. Curva de calibración de quercetina….……………………………………………....71 Figura 34. Correlación entre concentración del extracto hidroalcohólico de flores de Encelia canescens L. “girasol silvestre” y equivalente de quercetina (µg).……………..………………72 Figura 35. Curvas de calibración de las formulaciones del gel cosmético con Base 1 de Encelia canescens L. “girasol silvestre”, obtenidas por el método CUPRAC…………………….……74 Figura 36. Gráfica comparativa de intervalos de las formulaciones del gel cosmético con Base 1 de Encelia canescens L. “girasol silvestre”, evaluadas por el método CUPRAC……………...75 Figura 37. Prueba de comparaciones múltiples de Tukey IC (95%), para la variable TEAC, mostrando las diferencias entre las medias de las formulaciones (FXB1 7–20 %)………….….75 Figura 38. Curvas de calibración de las formulaciones del gel cosmético con Base 2 de Encelia canescens L. “girasol silvestre”, obtenidas por el método CUPRAC……………………..….....78 Figura 39. Gráfica comparativa de intervalos de las formulaciones del gel cosmético con Base 2 de Encelia canescens L. “girasol silvestre”, evaluadas por el método CUPRAC……….……..79 Figura 40. Prueba de comparaciones múltiples de Tukey IC (95%), para la variable TEAC, mostrando las diferencias entre las medias de las formulaciones (FXB2 7–20 %)………….….79 x Figura 41. Variación del (a) pH, (b) extensibilidad y (c) viscosidad del gel F4B1 durante el almacenamiento bajo condiciones de envase cerrado y abierto………………………………….86 Figura 42. Curva de calibración de Trolox para la determinación de la actividad antioxidante por el método FRAP…………………………………………………………………………………89 Figura 43. Correlación entre concentración del gel antioxidante y TEAC (mM), por el método FRAP. …………………………………………………………………………..……………….90 Figura 44. Curva de cuantificación de Trolox para la determinación de la actividad antioxidante por el método DPPH…………………………………………………………………………….91 Figura 45. Correlación entre concentración del gel antioxidante de Encelia canescens L. “girasol silvestre” y TEAC (mM), por el método DPPH………………………………………..………..92 Figura 46. Correlación entre concentración de la formulación de gel cosmético de Encelia canescens L. “girasol silvestre” y equivalente de ácido gálico (µg)……………….………..…..93 Figura 47. Correlación entre concentración de la formulación de gel cosmético de Encelia canescens L. “girasol silvestre” y equivalente de quercetina (µg)………………………….…...94 Figura 48. Correlación entre concentración de TEAC del gel antioxidante F4B1 y el gel comercial antioxidante, por el método CUPRAC…………………………………………………………..95 Figura 49. Diagrama de cajas mostrando la distribución y dispersión de los valores de TEAC...96 xi ÍNDICE DE ANEXOS ANEXO Nº 1: Constancia de clasificación taxonómica de Encelia canescens Lamarck “girasol silvestre”………………………………………………………………………………...……..110 ANEXO Nº 2: Tratamiento de la muestra vegetal de Encelia canescens Lamarck “girasol silvestre”……………………………………………………………………………………….111 ANEXO Nº 3: Obtención del extracto hidroalcohólico de partes aéreas de la de Encelia canescens Lamarck “girasol silvestre”………………………………………………….………………....112 ANEXO Nº 4: Obtención del extracto hidroalcohólico de flores de la de Encelia canescens Lamarck “girasol silvestre”…………………………………………………….……………....113 ANEXO Nº 5: Tamizaje fitoquímico preliminar para identificar metabolitos de los extractos hidroalcohólicos de Encelia canescens Lamarck “girasol silvestre”…………..…..…..……....114 ANEXO Nº 6: Caracterización fisicoquímica de los extractos hidroalcohólicos de flores de la de Encelia canescens Lamarck “girasol silvestre”……………….……………………... ……....116 ANEXO Nº 7: Ensayos de solubilidad de los extracto hidroalcohólico de flores de la de Encelia canescens Lamarck “girasol silvestre”…………………………..…………………….……....117 ANEXO Nº 8: Análisis comparativo y determinación de la actividad antioxidante de los extractos de Encelia canescens Lamarck “girasol silvestre”……….……….…………….……..……....118 ANEXO Nº 9: Determinación del contenido de polifenoles totales y flavonoides del extracto hidroalcohólico de flores de Encelia canescens Lamarck “girasol silvestre”…..………..…....119 ANEXO Nº 10: Evaluación de formulaciones para la selección del agente gelificante ………120 ANEXO Nº 11: Formulación del gel con extracto de flores de Encelia canescens Lamarck “girasol silvestre”, por el método de maceración..……………….…………….……………....122 ANEXO Nº 12: Ensayos organolépticos del gel formulado a partir del extracto de flores de Encelia canescens Lamarck “girasol silvestre”…..………………………….……….…..…....123 ANEXO Nº 13: Ensayos fisicoquímicos del gel formulado a partir del extracto de flores de Encelia canescens Lamarck “girasol silvestre”…..………………...……………….………....123 ANEXO Nº 14: Prueba de estabilidad preliminar del gel formulado a partir del extracto de flores de Encelia canescens Lamarck “girasol silvestre”…..………………………..…….………....124 ANEXO Nº 15: Control microbiológico del gel formulado a partir del extracto de flores de Encelia canescens Lamarck “girasol silvestre”…..…….…………………..…….…………....127 ANEXO Nº 16: Determinación de la actividad antioxidante al gel formulado a partir del extracto de flores de Encelia canescens Lamarck “girasol silvestre”…..……….………….……..…....128 ANEXO Nº 17: Determinación del contenido de polifenoles totales y flavonoides del gel formulado a partir del extracto de flores de Encelia canescens Lamarck “girasol silvestre”…………………………………………………………………………………….....129 ANEXO Nº 18: Comparación de actividad antioxidante por método de CUPRAC in vitro al gel formulado a partir del extracto de flores de Encelia canescens Lamarck “girasol silvestre”…..129 xii ABREVIATURAS ±EE: error estándar µg: microgramo µL: microlitro Abs: absorbancia Abs prom: absorbancia promedio ABTS: ácido 2,2′-azino-bis-(3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico) AE: área de extensibilidad ANOVA: análisis de varianza CAN: Comunidad Andina de Naciones cc: concentrado cP: centipoise CUPRAC: Capacidad Antioxidante Reductora del Cobre DPPH: 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo DS: desviación estándar EAU: extracción asistida por ultrasonido EH: extracto hidroalcohólico FDA: Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos FEQ: equivalentes a flavonoides FRAP: reducción del hierro férrico a ferroso g: gramo GAE: equivalentes de ácido gálico IC: intervalo de confianza IC50: Concentración Inhibitoria Media L.: Lamarck M: molar MEC: matriz extracelular mg: miligramos mL: mililitro mm: milímetro mM: milimolar xiii mm2: milímetro cuadrado MMPs: metaloproteinasas de matriz nm: nanómetro ºC: Grados Celsius OMS: Organismo Mundial de la Salud p/p: peso a peso QE: equivalentes de quercetina ROS: especies reactivas de oxígeno rpm: revoluciones por minuto Rx.: reacción SENAMHI: Servicio Nacional de Meteorología e Hidrología del Perú TAC: capacidad antioxidante total TEAC: capacidad antioxidante equivalente al Trolox TFC: flavonoides totales TPC: polifenoles totales TPTZ: 2,4,6-tri(2-piridil)-s-triazina Trolox: Ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico UFC: Unidades formadoras de Colonias USP: Farmacopea de los Estados Unidos UV: ultravioleta UVI: índice de ultravioleta v/v: volumen a volumen v:v:v: proporción volumétrica múltiple xiv RESUMEN El estrés oxidativo cutáneo desempeña un papel determinante en los procesos de envejecimiento y daño dérmico, lo que sustenta el interés por compuestos naturales con propiedades antioxidantes, como los polifenoles y flavonoides, para su aplicación en formulaciones cosméticas. Encelia canescens Lamarck “girasol silvestre” es una especie nativa de zonas áridas que contiene metabolitos bioactivos con potencial dermocosmético; sin embargo, no se ha documentado su incorporación en formulaciones tópicas estandarizadas ni su evaluación in vitro. El presente estudio tuvo como objetivo evaluar la actividad antioxidante in vitro del gel cosmético formulado a partir del extracto hidroalcohólico de Encelia canescens Lamarck. Los extractos hidroalcohólicos de partes aéreas y flores fueron obtenidos mediante maceración y extracción asistida por ultrasonido, y posteriormente sometidos a tamizaje fitoquímico, análisis fisicoquímico, ensayos antioxidantes (CUPRAC, FRAP y ABTS), cuantificación de compuestos fenólicos y flavonoides totales. El extracto floral obtenido por maceración presentó la mayor capacidad antioxidante y fue incorporado en geles a concentraciones de 7 %, 10 %, 13 %, 15 % y 20 %. La fórmula F4B1 al 15% fue evaluada en sus propiedades organolépticas, fisicoquímicas, microbiológicas y antioxidantes, incluyendo la comparación con un gel comercial mediante CUPRAC. Aunque el análisis ANOVA no evidenció diferencias significativas entre las formulaciones (p > 0,05), el gel F4B1 mostró la media más alta de capacidad antioxidante y parámetros fisicoquímicos óptimos. En conclusión, el gel cosmético de Encelia canescens Lamarck mostró actividad antioxidante cuantificable y cumplimiento microbiológico, consolidándose como un prototipo dermocosmético innovador para la protección cutánea frente al daño oxidativo. Palabras clave: Encelia canescens Lamarck, actividad antioxidante, gel cosmético, extracto hidroalcohólico, dermocosmética. xv ABSTRACT Cutaneous oxidative stress plays a decisive role in the processes of skin aging and dermal damage, supporting the growing interest in natural compounds with antioxidant properties, such as polyphenols and flavonoids, for their incorporation into cosmetic formulations. Encelia canescens Lamarck (“wild sunflower”) is a native species from arid regions containing bioactive metabolites with dermocosmetic potential; however, its inclusion in standardized topical formulations and its in vitro evaluation have not yet been reported. This study aimed to evaluate the in vitro antioxidant activity of a cosmetic gel formulated from the hydroalcoholic extract of Encelia canescens Lamack. Hydroalcoholic extracts from aerial parts and flowers were obtained by maceration and ultrasound-assisted extraction and subjected to phytochemical screening, physicochemical characterization, antioxidant assays (CUPRAC, FRAP, and ABTS), and quantification of total phenolic and flavonoid contents. The floral extract obtained by maceration exhibited the highest antioxidant capacity and was incorporated into gels at concentrations of 7%, 10%, 13%, 15%, and 20%. The F4B1 formulation at 15% was evaluated for its organoleptic, physicochemical, microbiological, and antioxidant properties, including comparative analysis with a commercial gel using the CUPRAC method. Although one-way ANOVA revealed no statistically significant differences among formulations (p > 0.05), the 15% F4B1 gel showed the highest mean antioxidant capacity and acceptable physicochemical parameters. In conclusion, the Encelia canescens Lamarck F4B1 cosmetic gel demonstrated quantifiable antioxidant activity, technological stability, and microbiological compliance, establishing itself as an innovative dermocosmetic prototype for skin protection against oxidative damage. Keywords: Encelia canescens Lamarck, antioxidant activity, cosmetic gel, hydroalcoholic extract, dermocosmetics. 16 I. INTRODUCCIÓN El envejecimiento cutáneo inducido por factores ambientales, conocido como fotoenvejecimiento, constituye un proceso degenerativo multifactorial que altera progresivamente la estructura y funcionalidad de la piel. Entre los factores extrínsecos, la radiación ultravioleta (UV) es el principal agente desencadenante, al inducir una sobreproducción de especies reactivas de oxígeno (ROS) que generan un desequilibrio redox dérmico, provocando peroxidación lipídica, oxidación proteica y daño al ADN (1,2). Además, las ROS estimulan la expresión de metaloproteinasas de matriz (MMPs), responsables de la degradación del colágeno y elastina, acelerando la pérdida de firmeza y elasticidad cutánea (3). Frente a estos procesos, la cosmética moderna ha evolucionado hacia un enfoque integral que aborda las necesidades fisiológicas y el bienestar sensorial de la piel. En este contexto, las plantas medicinales han adquirido un papel protagónico como fuentes sostenibles de metabolitos bioactivos con propiedades antioxidantes, antiinflamatorias y regeneradoras, fortaleciendo la convergencia entre innovación tecnológica y sostenibilidad (4). Según la Organización Mundial de la Salud (OMS), existen más de 20 000 especies de plantas medicinales distribuidas en 91 países, lo que representa un vasto potencial biotecnológico y cosmético. Este recurso natural ofrece la posibilidad de desarrollar ingredientes activos de origen vegetal mediante tecnologías modernas de extracción y estandarización, promoviendo productos más seguros y sostenibles. El creciente reconocimiento del valor de las materias primas vegetales ha impulsado a la industria cosmética global hacia formulaciones ecológicas y funcionales. Empresas como el Grupo L’Oréal proyectan que, para 2030, el 95 % de sus ingredientes procederá de fuentes renovables, reflejando la transición hacia una biocosmética sostenible. De igual modo, marcas asiáticas como Winona, Inoherb y Pechoin destacan por el uso de extractos botánicos con propiedades hidratantes, reparadoras y antioxidantes (5). El empleo tópico de antioxidantes constituye una estrategia efectiva para prevenir el daño oxidativo cutáneo. Estos compuestos neutralizan radicales libres y modulan enzimas implicadas en el deterioro dérmico (6). Dentro de ellos, los polifenoles y flavonoides destacan por su elevada capacidad reductora, estabilidad y biocompatibilidad, atributos que los posicionan como ingredientes de alto valor dermocosmético (7). En este contexto, los geles cosméticos representan vehículos idóneos por su estabilidad fisicoquímica, textura ligera y capacidad para liberar sostenidamente compuestos bioactivos, optimizando la eficacia antioxidante y la aceptabilidad sensorial de las formulaciones (8). 17 Encelia canescens Lamarck “girasol silvestre”, de la familia Asteraceae, es una especie nativa de zonas áridas del Perú. Los extractos etanólicos de sus hojas muestran presencia de compuestos fenólicos y flavonoides con actividad antioxidante (9). No obstante, las flores de esta especie no han sido caracterizadas fitoquímicamente, lo que representa una oportunidad de investigación con potencial aplicación cosmética. Por ello, el presente estudio tuvo como objetivo formular un gel cosmético con actividad antioxidante in vitro a partir del extracto hidroalcohólico de E. canescens Lamarck y evaluar su capacidad antioxidante mediante ensayos químicos estandarizados, complementados con una prueba preliminar de estabilidad térmica. 1.1 Descripción de la realidad problemática El envejecimiento cutáneo puede acelerarse por factores ambientales como la radiación UV, la contaminación y el estrés oxidativo generando pérdida de elasticidad, arrugas y manchas pigmentarias que afectan la salud y percepción estética (10,11). Se distinguen dos tipos de envejecimiento: intrínseco (cronosenescencia) y extrínseco (dermatoheliosis), este último considerado el más agresivo debido a su relación directa con la radiación UV y factores conductuales que favorecen la sobreproducción de especies reactivas de oxígeno (ROS) y el consecuente daño oxidativo térmico (12). A nivel mundial, la radiación UV constituye un importante factor de riesgo cutáneo. En Europa, entre el 70 % y 90 % de los melanomas se atribuyen a la exposición solar, generando más de 20 000 muertes anuales por cáncer de piel. En países mediterráneos como España, Italia y Grecia, los índices de radiación UV (UVI) pueden alcanzar valores de 9 o superiores en verano, disminuyendo a 5–8 en invierno (13). En el Perú, los niveles de radiación UV se encuentran entre los más altos del mundo. Según el SENAMHI, los valores promedio oscilan entre 8 y 15 en la costa, 10 a 17 en la sierra y 8 a 14 en la selva (14). Regiones como Ica registran picos de hasta 18, considerados peligrosos para la salud humana. Estas condiciones justifican el desarrollo de formulaciones cosméticas antioxidantes que prevengan el fotoenvejecimiento y mitiguen los efectos de la radiación solar (15). El interés por productos dermocosméticos antioxidantes ha crecido, pero la mayoría son importados, costosos y poco adaptados al entorno local (16). En este escenario, se planteó el desarrollo de un gel cosmético antioxidante a base del extracto hidroalcohólico de E. canescens L. orientado a valorizar un recurso vegetal nativo mediante una formulación eficaz, sostenible y accesible. 1.2 Formulación del problema ¿Presentará actividad antioxidante in vitro el gel cosmético formulado a partir del extracto hidroalcohólico de Encelia canescens Lamarck “girasol silvestre? 18 1.3 Objetivos de la investigación 1.3.1 Objetivo General Evaluar la actividad antioxidante in vitro del gel cosmético formulado a partir del extracto hidroalcohólico de Encelia canescens Lamarck “girasol silvestre”. 1.3.2 Objetivo Específico ❖ Determinar la actividad antioxidante del extracto hidroalcohólico de Encelia canescens Lamarck “girasol silvestre”. ❖ Determinar el contenido de polifenoles y flavonoides totales del extracto hidroalcohólico de Encelia canescens Lamarck “girasol silvestre”. ❖ Formular un gel cosmético con actividad antioxidante a partir del extracto hidroalcohólico de Encelia canescens Lamarck “girasol silvestre”. ❖ Determinar el contenido de polifenoles y flavonoides totales del gel cosmético con actividad antioxidante a partir del extracto hidroalcohólico de Encelia canescens Lamarck “girasol silvestre”. ❖ Efectuar el control de calidad organoléptico y fisicoquímico del gel cosmético formulado a partir del extracto hidroalcohólico de Encelia canescens Lamarck “girasol silvestre”. ❖ Efectuar el control microbiológico del gel cosmético formulado a partir del extracto hidroalcohólico de Encelia canescens Lamarck “girasol silvestre”. ❖ Comparar la actividad antioxidante in vitro del gel cosmético formulado a partir del extracto hidroalcohólico de Encelia canescens Lamarck “girasol silvestre” con un gel antioxidante comercial. 1.4 Justificación e importancia La revisión de bases de datos especializadas (PudMed, Scopus, SciELO, Cosmetics, ScienceDirect), evidenció que Encelia canescens Lamarck es una especie nativa del Perú, tradicionalmente empleada con fines medicinales y adaptada a ecosistemas áridos (17). Estudios recientes reportan que los extractos etanólicos de sus hojas presentan actividad antioxidante y antiinflamatoria, atribuida a la presencia de flavonoides y triterpenoides, lo que la convierte en una fuente prometedora de compuestos bioactivos con aplicación dermocosmética (9). Sin embargo, no existen investigaciones que evalúen su incorporación en formulaciones tópicas estandarizadas bajo criterios de eficacia, estabilidad y seguridad. El estrés oxidativo cutáneo es un factor clave en la degradación dérmica, por lo que el uso de antioxidantes naturales constituye una estrategia eficaz para preservar la funcionalidad de la piel (18). En este contexto, los geles cosméticos se destacan por su biocompatibilidad, textura ligera y capacidad de liberar de forma controlada principios activos antioxidantes e hidratantes (19). El desarrollo de un gel facial con 19 extracto hidroalcohólico de E. canescens ofrece una opción natural, accesible y sostenible para la prevención del daño oxidativo de la piel, además de contribuir a la valorización de la biodiversidad peruana y al fortalecimiento de la innovación científica nacional en dermocosmética. 1.5 Antecedentes de investigación Se realizó una revisión bibliográfica sobre Encelia canescens Lamarck “girasol silvestre”, enfocada en sus propiedades fitoquímicas, farmacológicas y antioxidantes, identificándose investigaciones que respaldan su potencial biológico.  Fernández F, et al. (9), en 2020, desarrollaron en Trujillo (Perú) el estudio “Protection of Erythrocytes against Lipoperoxidation and Anti- inflammatory Effects of Ethanolic Extract of Encelia canescens Lam Leaves in Mice”, donde el extracto etanólico de hojas demostró efecto antiinflamatorio y protección frente a la lipoperoxidación eritrocitaria inducida por H₂O₂, atribuida a la presencia de flavonoides y triterpenoides.  Cayún et al. (20), en 2015, en la investigación “Preclinical Evaluation of the Encelia canescens Lam Extract: Medicinal Properties useful for Cancer Treatment”, identificaron metabolitos secundarios —saponinas, terpenos, flavonoides, cumarinas y taninos— mediante pruebas fitoquímicas, además de cuantificar compuestos fenólicos y flavonoides totales. Los ensayos antioxidantes ABTS y DPPH confirmaron la capacidad reductora de los extractos etanólico y acuoso.  Cochachi y Fernández (21), en 2015, evaluaron la “Toxicidad aguda y efecto hepatoprotector del extracto etanólico de los tallos de Encelia canescens Lamarck, en ratas en un modelo de intoxicación con paracetamol”, se evidenció la presencia de aminoácidos, esteroides y/o triterpenoides, antraquinonas, flavonoides, los cuales se asociaron con el efecto hepatoprotector. Además, el estudio clasificó el extracto como no tóxico (DL₅₀ > 2000 mg/kg), según los criterios de Williams descrita en el Manual de Técnicas de Investigación CYTED (1995).  Sepúlveda (22), en 2007, amplió el conocimiento con su “Estudio fitoquímico y farmacológico de Encelia canescens Lam. Asteraceae”, analizó las partes aéreas y hojas frescas, obteniéndose mayores rendimientos con los extractos metanólico y diclorometánico. Se identificaron metabolitos como esteroles, triterpenos, flavonoides y cumarinas. Sin embargo, el extracto metanólico global de la parte aérea no mostró actividad antioxidante significativa en el ensayo DPPH. 20 1.6 Marco teórico 1.6.1 Encelia canescens Lamarck “girasol silvestre” ➢ Clasificación taxonómica: La especie fue identificada y clasificada taxonómicamente en el Museo de Historia Natural de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos, confirmando su pertenencia a la familia Asteraceae. Su clasificación taxonómica es la siguiente: ORDEN: Asteraceae Link FAMILIA: Asteraceae Bercht & J. Presl GÉNERO: Encelia Adans. ESPECIE: Encelia canescens Lamarck NOMBRE VULGAR: Flor amarilla, girasol silvestre, coronilla del Fraile (23). ➢ Descripción morfológica: La especie Encelia canescens Lamarck es una planta arbustiva perenne (30-80 cm), adaptada a ambientes áridos de Chile, Perú y Argentina. Presenta tallos verde plomizos cubiertos de pilosidad blanca, hojas alternas, pecioladas, y oblongas e inflorescencias terminales amarillas con flores liguladas femeninas infértiles y flores tubulosas fértiles castañas, características de la familia Asteraceae (22). Figura 1. Fotografía de Encelia canescens Lamarck “girasol silvestre” - Distrito de Rosario de Yauca (Molletambo, Ica) Figura 1. Fotografía de Encelia Canescens Lamarck “girasol silvestre” - Distrito de Rosario de Yauca (Molletambo, Ica) Figura 2. Fotografía de Encelia Canescens Lamarck “girasol silvestre” - Distrito de Rosario de Yauca (Molletambo, Ica) Figura 3. Fotografía de Encelia Canescens Lamarck “girasol silvestre” - Distrito de Rosario de Yauca (Molletambo, Ica) 21 Figura 2. Planta entera de Encelia canescens Lamarck “girasol silvestre” Fuente. Rodríguez R. et al. (Catálogo de las plantas vasculares de Chile) (24) ➢ Distribución geográfica y hábitat: Encelia canescens L., es una especie arbustiva nativa de Sudamérica, crece de forma natural en suelos arenosos y secos a lo largo de la costa peruana, particularmente en Molletambo (Rosario de Yauca, Ica) y en zonas áridas del norte de Chile y Argentina, entre los 1 000 – 1 700 m.s.n.m. (22). ➢ Usos: En comunidades del norte de Chile, Perú y Argentina, Encelia canescens L. se usa tradicionalmente por sus propiedades galactóforas, empleándose para estimular la producción de leche materna en mujeres lactantes y como remedio frente a la retención urinaria. Asimismo, diversas especies del género Encelia han sido reportadas con propiedades analgésicas, utilizadas tradicionalmente en el tratamiento de afecciones odontálgicas. Además de su valor ornamental y apícola (22). 1.6.2 PROCESO EXTRACTIVO (25) El proceso extractivo es una operación unitaria de transferencia de materia, mediante la cual los principios activos o metabolitos se difunden desde una fase original hacia otra, denominada fase solvente, que constituirá el extracto final. Este proceso permite aislar compuestos de interés biológico presentes en matrices vegetales, optimizando su recuperación en función de la polaridad del 22 disolvente y de la naturaleza de la muestra. Existen varias formas de extracción, entre ellas, para la presente investigación se emplearon dos de ellas: Figura 3. Proceso extractivo (25) Fuente. Ferraro G, et al. La maceración es una técnica sólido-líquido en la que la droga vegetal se deja en contacto con un disolvente (agua, etanol o mezcla hidroalcohólica) para permitir la difusión de los compuestos; mientras que, la extracción por ultrasonido es una técnica de intensificación extractiva que emplea ondas ultrasónicas de alta frecuencia para generar cavitación, mejorando la liberación de metabolitos y reduciendo el tiempo y consumo de disolvente. 1.6.3 EXTRACTOS Los extractos vegetales son soluciones de fitocomplejos obtenidas por maceración o percolación de la droga vegetal en disolventes como agua, etanol o glicerina, seguidas de la concentración del solvente hasta alcanzar la fracción activa (26). En cosmética, los extractos fluidos hidroalcohólicos (20-60 %) son los más usados por su estabilidad y alta concentración de metabolitos, actuando como ingredientes antioxidantes, antiinflamatorias y regeneradores frente al fotoenvejecimiento cutáneo (27, 28). 1.6.4 PIEL La piel es el órgano de interfaz directa con el entorno y constituye la primera barrera de defensa frente a agentes físicos, químicos y biológicos. Su integridad depende del estrato córneo, capa externa de la epidermis responsable de mantener la homeostasis hídrica y electrolítica y de proteger contra la radiación ultravioleta (UV), los agentes oxidativos y los microorganismos patógenos. Está compuesta por tres capas: epidermis, dermis y tejido subcutáneo. La epidermis, formada principalmente por queratinocitos, culmina en el estrato córneo, constituido por células anucleadas que actúan como barrera protectora. La dermis, más gruesa, está integrada por una matriz extracelular (MEC) de colágeno, elastina y proteoglucanos sintetizados por fibroblastos, que otorgan 23 resistencia, firmeza y elasticidad. Durante el envejecimiento cutáneo, la dermis sufre adelgazamiento, reducción del colágeno y degradación de fibras elásticas, lo que se traduce en pérdida de firmeza, elasticidad y tono. Estas alteraciones, intensificadas por el estrés oxidativo y la exposición solar, justifican el interés en formulaciones antioxidantes capaces de preservar la estructura y funcionalidad cutánea (29, 30). Figura 4. La piel (26) Fuente. Álvarez y Bague 1.6.5 ANTIOXIDANTE Los antioxidantes son compuestos capaces de prevenir la oxidación de moléculas lipídicas insaturadas, preservando la estabilidad química de las formulaciones cosméticas. Al oxidarse preferentemente, evitan la rancidez, la decoloración y olores indeseables, prolongando la vida útil del producto (25). En la piel, los sistemas antioxidantes endógenos y dietarios constituyen una defensa natural frente al fotodaño; sin embargo, su eficacia disminuye con la edad y la exposición crónica a radiación ultravioleta. Por ello, la aplicación tópica de antioxidantes representa una estrategia afectiva para mitigar el estrés oxidativo cutáneo y fotoenvejecimiento. Estos compuestos neutralizan radicales libres, inducidos por radiación UV, inhiben la activación de metaloproteinasas y preservan el colágeno y las proteínas estructurales dérmicas, reduciendo el daño oxidativo cutáneo (5). Radicales libres Los radicales libres son átomos o moléculas con uno o más electrones desapareados en su capa externa, lo que les confiere inestabilidad química y alta reactividad. Esta condición los impulsa a captar electrones de otras moléculas 24 para alcanzar un estado más estable. Durante la transferencia, la molécula donadora pierde un electrón y se convierte a su vez en un nuevo radical, generando una reacción en cadena capaz de alterar estructuras celulares y componentes biológicos esenciales. (12) Polifenoles y flavonoides como agentes bioactivos (12) Los polifenoles son metabolitos secundarios de origen vegetal ampliamente distribuidos en el reino vegetal, reconocidos por su capacidad antioxidante y fotoprotectora. Al no ser sintetizados por el organismo humano, deben incorporarse a través de la dieta o de formulaciones tópicas. Dentro de este grupo, los flavonoides son una de las clases más abundantes y se caracterizan por un esqueleto carbonado C₆–C₃–C₆, compuesto por dos anillos aromáticos (A y B) unidos mediante una unidad heterocíclica de tres carbonos (C) (Figura 6). Figura 5. Esqueleto carbónico C6-C3-C6, que forma los diversos flavonoides (A), y un flavonol formado a partir de este esqueleto, la quercetina (B) (12) Fuente. Ribeiro C. A partir de este esqueleto básico se derivan las principales subclases: flavonas, flavononas, flavonoles, antocianinas e isoflavonoides, cuyas variaciones estructurales determinan su capacidad antioxidante y biológica. En la actualidad, los compuestos polifenólicos son ampliamente incorporados en formulaciones cosméticas destinadas al cuidado de la piel fotoexpuesta y envejecida, debido a su eficacia como neutralizadores de radicales libres y agentes protectores frente al estrés oxidativo. 1.6.5 COSMÉTICOS Según la Food and Drug Administration (FDA), los cosméticos son formulaciones destinadas a aplicarse sobre el cuerpo humano con el fin de limpiar, embellecer o modificar la apariencia, sin alterar su estructura ni función biológica (31). En el ámbito nacional, la Comunidad Andina regula estos productos mediante la Decisión 833 – Armonización de Legislaciones en 25 Materia de Productos Cosméticos, que los define como sustancias o preparaciones aplicadas sobre las partes superficiales del cuerpo humano - epidermis, el sistema piloso y capilar, las uñas, labios, los órganos genitales externos, dientes o las mucosas bucales—, con el propósito de limpiar, perfumar, proteger o mejorar su aspecto (32). El Reglamento Técnico Andino complementa esta normativa al establecer las especificaciones fisicoquímicas y microbiológicas que garantizan la inocuidad y estabilidad del producto (33). Asimismo, la Resolución N.º 1906 clasifica las formas cosméticas según su naturaleza y presentación, incluyendo aerosoles, barras, ceras, cremas en gel, esmaltes, lociones, pastas, perlas, polvos, pomadas y suspensiones, entre otras (34). Figura 6. Función y vías antienvejecimiento de los ingredientes derivados de plantas en cosméticos (5) Fuente. Sciencedirect Gel: son dispersiones monofásicas semisólida obtenidas por gelificación de medios acuosos u oleoso con agentes poliméricos, de origen vegetal o sintético; aumentan la viscosidad y estabilidad de la formulación. Durante la gelificación, las macromoléculas se hidratan y forman una red tridimensional capaz de retener el disolvente otorgando al sistema una textura homogénea, estable y cosméticamente agradable (25). Figura 7. Ventajas, desventajas y aplicaciones cosméticas de los geles frente a otros sistemas vehiculares (8) Fuente. Gels 26 II. ESTRATEGIA METODOLÓGICA 2.1 Tipo, nivel y diseño de investigación (35) 2.1.1 Tipo de investigación Tipo aplicada, ya que los resultados que se obtuvieron se emplearon para la formulación del gel con actividad antioxidante. 2.1.2 Nivel de investigación Descriptivo – explicativo, debido a que se realizó la descripción del nivel antioxidante del gel. 2.1.3 Diseño de investigación Diseño experimental - transversal, porque se manipularon variables para formular y evaluar un gel antioxidante a base de Encelia canescens Lamarck. 2.2 Lugar de investigación Universidad Nacional San Luis Gonzaga, Facultad de Farmacia y Bioquímica, departamento de Ciencias Farmacéuticas, Laboratorio de Química General – Laboratorio de Farmacotécnia e Industria farmacéutica. 2.3 Variables: 2.3.1 Variable Independiente: Gel cosmético formulado a partir del extracto hidroalcohólico de Encelia canescens Lamarck “girasol silvestre”. 2.4.2 Variable Dependiente: Actividad antioxidante 2.4 Población y muestra 2.4.1 Población La población vegetal estuvo conformada por la especie Encelia canescens Lamarck “girasol silvestre”. 2.4.2 Muestra: La muestra vegetal estuvo conformada por 6 kilos de las partes aéreas de Encelia canescens Lamarck “girasol silvestre”. 2.5 Métodos, técnicas y procedimientos para la recolección de datos 2.5.1 Recolección de la muestra vegetal: (36) La especie Encelia canescens Lamarck “girasol silvestre” fue recolectada durante los meses de marzo y abril de 2025, en el centro poblado de Molletambo, ubicado en el distrito de Rosario de Yauca, provincia de Ica, región de Ica (Ica-Perú). La recolecta se llevó a cabo a primeras horas de la mañana, con el propósito de que el material vegetal sea trasladado en buen estado. 27 Figura 8. Lugar de la recolección (Molletambo – Ica) 2.5.2 Determinación de la identidad de la muestra vegetal: El material vegetal fue autenticado en el Herbario del Museo de Historia Natural de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos (Id. 028-USM-MHN-2025), según el Sistema de Clasificación APG IV (2016) (ANEXO Nº 1). 2.5.3 Tratamiento de la muestra: (ANEXO Nº 2) (37) • Selección: Tabla 1. Criterios de inclusión y exclusión de las muestras de Encelia canescens L. “girasol silvestre” CATEGORÍA CRITERIOS Inclusión • Partes aéreas (hojas, flores y tallos) sin signos de marchitez ni deterioro, entera, que no han sido atacadas por insectos. • Plantas correctamente identificadas por un especialista en taxonomía. • Almacenamiento en sobres de papel Kraft, que garantizaron protección frente a humedad y descomposición durante transporte y procesamiento. Exclusión • Muestras con descomposición, daño físico, infestación por insectos o residuos externos. • Plantas con identificación botánica incorrecta. • Especímenes cuyo material vegetal no pudiera conservarse en condiciones adecuadas. • Muestras deterioradas durante el transporte. 28 • Limpieza: Se realizó con el objetivo de evitar la presencia de residuos de tierra otras sustancias y así evitar alteraciones en los resultados por una posible contaminación. • Secado y estabilización: Se llevó a cabo de forma natural en el laboratorio bajo sombra 3 semanas aproximadamente, luego se realizó la operación estabilización de la muestra, utilizando una estufa: para el secado de las partes aéreas se realizó a una temperatura de 38 ºC y para flores se realizó a una temperatura de 35 ºC, hasta lograr el peso constante (38). Este proceso permitió preservar las características fitoquímicas de las muestras y facilitar su posterior extracción. • Fragmentación: Tanto las partes aéreas como las flores, se colocaron en grupos distintos, posteriormente, el material vegetal fue triturado mediante un molino manual previamente limpiado y desinfectado, con el fin de obtener partículas más pequeñas y homogéneas, lo cual facilitó su procesamiento o extracción de los compuestos activos. • Conservación: Los órganos aéreos y el material floral se guardaron en bolsas de papel Kraft debidamente rotuladas. 2.5.4 Obtención del extracto hidroalcohólico de partes aéreas de la especie: (ANEXO 3) (39) • Método de maceración: La muestra se maceró con etanol al 70 % (v/v) durante 15 días a temperatura ambiente, protegidas de la luz y con agitación manual intermitente. Finalizado el proceso, el macerado se filtró (papel Whatman N.º 40 y gasa estéril), y se concentró por evaporación parcial a temperatura ambiente hasta obtener el extracto fluido. • Método de ultrasonido: La EAU se realizó con etanol al 70 % (v/v) durante 2 h, distribuidas en seis intervalos de 20 min con agitación manual entre ciclos. El extracto se filtró (papel Whatman N.º 40 y gasa estéril) y se concentró por evaporación parcial a temperatura ambiente, conservándose en bandejas rotuladas hasta su secado (40). 2.5.5 Obtención del extracto hidroalcohólico de flores de la especie: (ANEXO 4) • Método de maceración: Las flores secas se maceraron en una mezcla glicerina-agua destilada (4:3, v/v) durante 15 días a temperatura ambiente, en frascos de vidrio ámbar cubiertos con papel Kraft para protegerlas de la 29 luz. Finalizado el proceso, el macerado se filtró y se almacenó en frascos ámbar etiquetados hasta su utilización. • Método de ultrasonido: Se aplicó extracción asistida por ultrasonido (EAU) utilizando la misma mezcla glicerina-agua destilada (4:3, v/v). Las flores se distribuyeron en dos matraces aforados de 500 mL con igual volumen de disolvente y se sometieron a baño ultrasónico durante 2 h, en seis ciclos de 20 min con agitación intermedia. Finalizado el proceso, el extracto se filtró doblemente y se almacenó en frascos ámbar etiquetados para su conservación. Figura 9. Flujograma de la obtención de los extractos hidroalcohólicos 30 2.5.6 Tamizaje fitoquímico: (ANEXO Nº 5) (41) Los extractos fueron sometidos a análisis fitoquímico para identificar cualitativamente los principales grupos químicos presentes en Encelia canescens L. La caracterización se efectuó mediante reacciones de coloración y formación de precipitados, siguiendo el método de Olga Lock. 2.5.6.1 Determinación de taninos ❖ Reacción de gelatina – sal: En tres tubos con NaCl al 5 %, gelatina al 1 % y reactivo gelatina– sal se adicionó el extracto. La presencia de precipitado indica taninos; el cambio de color con FeCl₃ (azul, verde o negro) confirma la reacción. ❖ Reacción de cloruro férrico: En un tubo de ensayo se coloca 0.5 mL. de la Fracción A se le adiciona una gota de solución acuosa de FeCl3 1%. Reacción (+): cambio de colores azul-negro, verde o azul verdoso. 2.5.6.2 Determinación de aminoácidos ❖ Reacción de Ninhidrina: Sobre papel de filtro se aplicó una gota del extracto y otra del reactivo al 2 %. Tras el secado, la coloración azul violácea indicó resultado positivo frente al testigo de metionina 5 %. 2.5.6.3 Determinación de flavonoides ❖ Reacción de Shinoda: En una placa excavada se colocaron 3 gotas del extracto, adicionado 5 limaduras de magnesio y 2 gotas de HCl concentrado. Siendo la reacción positiva si el desarrollo inmediato de coloración fue color rojo, anaranjado o violeta. 2.5.6.4 Determinación de triterpenoides y/o esteroides ❖ Reacción de Liebermann – Burchard: Sobre una placa excavada, sobre 1 mL de la fracción B, se mezclaron 5 gotas de anhidrido acético y 3 mL de ácido sulfúrico concentrado. Esta mezcla se agregó con cuidado y enfriando, a 50 mL de etanol (preparar poco antes de su uso). La reacción es positiva si se observan colores verdes o azul verdoso (vías rojo o azul). 2.5.6.5 Determinación de antraquinonas ❖ Reacción de Bornträger: Sobre el resto de la fracción B y se le añadió 5 ml de NaOH 5% en un tubo de ensayo. Posterior a ello, se tapó el tubo y se agitó 31 ligeramente, para después, dejar reposar hasta que se distinguieron las dos fases. Siendo la reacción positiva si la fase acuosa adquiere un color rojo. 2.5.6.6 Determinación de alcaloides El resto de la Fracción C se evapora a sequedad y luego se adicionó 2ml de HCl 1%, y se filtró. ❖ Reacción de Mayer: Se adicionaron 2 a 3 gotas del reactivo, siendo la reacción positiva si presentó un precipitado color blanco a crema. ❖ Reacción de Dragendorff: Se adicionaron 2 a 3 gotas del reactivo, siendo la reacción positiva si presentó un precipitado de color rojo a naranja. ❖ Reacción de Wagner: Se agregaron de 2 a 3 gotas del reactivo, se observa el precipitado. Siendo la reacción positiva si al aspersar se observaron la formación de manchas marrones. 2.5.6.7 Determinación de leucoantocianidinas y/o catequinas ❖ Reacción de Rosenheim: Se calentó 0,2 mL del extracto con HCl concentrado por 10 min; se adicionaron agua y alcohol amílico. Color rosado-carmesí: leucoantocianidinas; marrón: catequinas. 2.5.6.8 Determinación de saponinas A 1 gr droga seca, se le agregó 20 ml de agua destilada, se dejó hervir durante 15 minutos. Se filtró en caliente hasta completar a volumen (10mL), y se dejó enfriar, esto constituyó la fracción F. ❖ Prueba de espuma: En dos tubos de ensayo se agitaron 2,5 ml de la cocción por un minuto. Se dejó reposar 15 minutos y se observó la formación de espuma. Se considera negativa la reacción si la altura de la espuma es < 5 mm. 32 Figura 10. Flujograma de marcha fitoquímica preliminar para identificar metabolitos secundarios Fuente. Olga Lock. 33 2.5.7 Caracterización Fisicoquímica del extracto: (ANEXO Nº6) ❖ Actividad de agua (Aw): (42) La determinación se realizó en la droga vegetal seca (flores) mediante un medidor digital de actividad de agua (Graigar® WA-160A), basado en sensor capacitivo a 25 ± 1 °C. Las mediciones se efectuaron por triplicado (n = 3). ❖ Sólidos totales: AOC 925.03B (42) Se colocaron 2 g del extracto en una placa Petri tarada y se secaron en estufa a 105 °C por 1 h. La muestra se enfrió en desecador durante 30 min y se pesó. Se repitió el proceso de secado bajo las mismas condiciones por 1 h adicional, realizando el enfriamiento y pesado final. El porcentaje se calculó con la siguiente fórmula: % de solidos totales = w de la placa con residuo − w de la placa vacía w de la muestra x100 ❖ Sólidos solubles: AOAC 932.12 (42) Se preparó una solución al 10 % p/p del extracto en agua destilada y se midió el índice refractométrico con refractómetro digital calibrado (ºBrix). ❖ Cenizas: AOAC 923.03 Ash (42) Se pesaron 2 g de extracto en cápsulas de porcelana previamente calcinadas, las cuales se incineraron en mufla a 600 °C durante 2 h hasta obtener peso constante. El porcentaje de cenizas totales representa la materia inorgánica residual (sales y minerales), usando la fórmula: % de cenizas = (P3 − P1) (P2 − P1) x 100 P1: peso en gramos de la cápsula vacía y calcinada P2: peso en gramos de la cápsula con la muestra P3: peso en gramos de la cápsula con el residuo inorgánico tras calcinación. ❖ pH: AOAC 981.12 (42) Se preparó una suspensión al 10% p/p del extracto en agua destilada y se midió el pH mediante potenciómetro previamente calibrado con soluciones buffer pH 4 y 7, a temperatura ambiente. ❖ Porcentaje de rendimiento: (43) El rendimiento se calculó considerando la masa total del extracto líquido recuperado (Pf) en relación con el peso inicial de la muestra seca molida (Pi), mediante la fórmula: % Rendimiento = Pf Pi x 100 34 2.5.8 Pre-formulación del gel cosmético: 2.5.8.1 Solubilidad: (ANEXOS Nº 7) El coeficiente de solubilidad corresponde a la cantidad máxima de soluto disuelto en un volumen de disolvente a una temperatura determinada. Este estudio se realizó con el fin de identificar incompatibilidades entre el extracto y los excipientes, y seleccionar los vehículos adecuados para la formulación, evaluando en diferentes disolventes considerando factores como temperatura, pH, tamaño de partícula y agitación. Para ello, se colocaron 5 mL de cada disolvente en tubos de ensayo, se añadió una cantidad mínima de extracto, y se agitó hasta alcanzar el equilibrio (26). Cada ensayo se realizó por triplicado, y se expresó mediante la fórmula: 𝑚𝐿 𝑑𝑖𝑠𝑜𝑙𝑣𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑔 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑜 = 5 𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑝𝑟𝑜𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 (𝑔)𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑑𝑖𝑠𝑢𝑒𝑙𝑡𝑎 La solubilidad de los extractos se clasificó conforme a los criterios establecidos por la United States Pharmacopeia (USP38/NF33) y las recomendaciones del Scientific Committee on Consumer Safety, que definen los rangos cuantitativos de solubilidad expresados en g/L y las partes de disolvente requeridas por parte de soluto (Tabla 2). Tabla 2. Definición de los términos de solubilidad (adaptado de la Farmacopea de los Estados Unidos, Formulario Nacional —USP38/USP38–NF33* y Avisos Generales) y de la Farmacopea Europea, 11.ª edición) (44) Término Partes de disolvente requeridas para 1 parte de soluto Solubilidad expresada en g/L Muy soluble Menos de 1 parte >1000 Fácilmente soluble 1 a 10 partes 100 - 1000 Soluble 10 a 30 partes 33,3 – 100 Poco soluble 30 a 100 partes 10 – 33,3 Ligeramente soluble 100 a 1000 partes 1 – 10 Muy ligeramente soluble 1000 a 10 000 partes 0,1 – 1 Prácticamente insoluble o insoluble >10 000 partes (o igual a 10 000 partes) < 0,1 o = 0,1 Fuente. Cosmetic Ingredient Review 35 2.5.8.2 Análisis comparativo y determinación de la actividad antioxidante de los extractos por los métodos CUPRAC, FRAP y ABTS: (ANEXO Nº 8) Con propósito de seleccionar el extracto con mayor potencial antioxidante para su incorporación en la formulación cosmética, se evaluó la actividad antioxidante de los extractos obtenidos mediante los métodos CUPRAC, FRAP y ABTS. Esta etapa permitió comparar cuantitativamente su capacidad reductora. ❖ Determinación de la actividad antioxidante mediante el método de reductora de iones cúpricos (CUPRAC) Este método, desarrollado por primera vez por Apak y sus colaboradores (45) está basado en la reducción de iones cúpricos mediante antioxidantes, se evaluó la capacidad de un compuesto para reducir un oxidante, provocando un cambio de color cuya intensidad será proporcional a la capacidad antioxidante total, a medida que los iones Cu²⁺ se reduzcan a Cu⁺. Este ensayo empleó Cu (II)-Nc como reactivo oxidante, formando Cu (I)-Nc al reducirse con antioxidantes. Su absorbancia se medió a 450 nm, generando un color amarillo anaranjado. La reacción finalizó en 30 minutos. (46) Preparación de reactivo CUPRAC: Los reactivos utilizados fueron: ✓ Solución buffer de acetato de amonio NH4 (CH3COO) 1M de pH 7. ✓ Solución etanólica de Neocuproina. ✓ Solución de cloruro de cobre dihidratado. ✓ Solución de patrón. (Trolox). Procedimiento para el extracto: Se pesaron 25 mg de extracto de pares aéreas, los cuales fueron disueltos en 5 mL de etanol; se midieron 900 µL de extracto de flores, los cuales fueron disueltos en 100 µL de etanol, ambas muestras sometidas a ultrasonido para garantizar su homogenización. Posteriormente, para ambos extractos, se prepararon diluciones seriadas mediante la adición de 500 μL de etanol. De cada dilución, se transfirieron 50 μL a viales ámbar, a los que se añadieron 1200 μL de agua destilada y 750 μL del reactivo CUPRAC. El blanco se preparó sustituyendo la muestra 36 por 50 μL de etanol, manteniendo las mismas proporciones de los demás reactivos. Figura 11. Proceso de disolución de la muestra de extracto partes aéreas para el método CUPRAC ❖ Determinación de la actividad antioxidante mediante el método de reducción del hierro férrico a ferroso (FRAP) Se determinó empleando el procedimiento descrito por Benzie y Strain (1996) con algunas modificaciones. Este método se utilizó para evaluar la capacidad antioxidante de una muestra, basándose en su habilidad para reducir el ion férrico (Fe³⁺) en un complejo con 2,4,6-tri(2-piridil)-s-triazina (TPTZ) a su forma ferrosa (Fe²⁺) mediante la donación de electrones por parte de los antioxidantes. Su absorbancia se medió a 593 nm, generando un color azul intenso. La reacción finalizó en 30 minutos. (47) Preparación de reactivo FRAP: ✓ Solución tampón de acetato de sodio (NaCH₃COO) 300 mM, ajustada a pH 3.6. ✓ Solución de TPTZ (2,4,6-tripiridil-s-triazina) 10 mM preparada en HCl 40 mM. ✓ Solución de cloruro férrico (FeCl₃·6H₂O) 20 mM en agua destilada. Las soluciones se combinaron en una proporción de 10:1:1 (v:v:v). La absorbancia inicial del reactivo preparado se registró a 593 nm para su estandarización. 37 Procedimiento para el extracto: ❖ Se pesaron 25 mg de extracto de pares aéreas, los cuales fueron disueltos en 5 mL de etanol; se midieron 100 uL de extracto de flores, los cuales fueron disueltos en 900 uL de etanol, ambas muestras sometidas a ultrasonido para garantizar su homogenización. ❖ Posteriormente, se prepararon diluciones seriadas mediante la adición de 500 μL de etanol. En los viales ámbar, a los que se añadieron 1500 μL de reactivo y se transfirieron 50 μL de cada dilución. ❖ El blanco se preparó sustituyendo la muestra por de etanol, manteniendo las mismas proporciones de los demás reactivos. Figura 12. Proceso de disolución de la muestra de extracto partes aéreas para el método FRAP ❖ Determinación de la actividad antioxidante mediante el método ácido 2,2′-azino-bis-(3-etilbenzotiazolina-6- sulfónico) (ABTS) Este método descrito por Miller et al. (1993), se emplea para determinar la capacidad antioxidante total (TAC) de una muestra mediante la reducción del catión radical ABTS⁺, un cromóforo azul verdoso con máxima absorbancia a 734 nm. Los antioxidantes presentes en la muestra neutralizan el radical 38 ABTS⁺ mediante mecanismos de transferencia de electrones o de átomos de hidrógeno, provocando una disminución en la absorbancia que es proporcional a la actividad y concentración de los compuestos antioxidantes (48). Preparación de reactivo ABTS: ✓ Solución madre de ABTS: 0,0504 g de ABTS disueltos en 5 mL de agua grado HPLC con 6,7 mg de persulfato de potasio (K₂S₂O₈). ✓ Condiciones de reacción: se mantuvo en oscuridad durante 16–18 h para formar el radical ABTS⁺·. ✓ Solución de trabajo: 1 mL del radical diluido en ~70 mL de etanol al 96 % (v/v), ajustando la absorbancia a 0,680 ± 0,020 a 734 nm. ✓ Las soluciones se combinaron en una proporción 10:1:1 (v:v:v). Procedimiento para el extracto: • Se pesaron 25 mg de extracto de pares aéreas, los cuales fueron disueltos en 5 mL de etanol; se midieron 150 µL de extracto de flores, los cuales fueron disueltos en 850 uL de etanol, ambas muestras sometidas a ultrasonido para garantizar su homogenización. • Posteriormente, se prepararon diluciones seriadas mediante la adición de 500 μL de etanol. En los viales ámbar, a los que se añadieron 1000 μL de reactivo y se transfirieron 25 μL de cada dilución. • 39 Figura 13. Proceso de disolución de la muestra de extracto partes aéreas para el método ABTS 2.5.8.3 Determinación del contenido de polifenoles totales y flavonoides del extracto hidroalcohólico de flores de Encelia Canescens Lamarck “girasol silvestre”, por el método de maceración: (ANEXO Nº 9) La cuantificación de polifenoles totales (TPC) y flavonoides totales (TFC) se efectuaron con el propósito de caracterizar y comparar el contenido de metabolitos antioxidantes presente en el extracto de Encelia canescens Lamarck elegido para la formulación. Asimismo, los valores de TPC y TFC se consideraron parámetros de estandarización química y control de calidad, esenciales para la reproducibilidad y consistencia del gel cosmético formulado. ❖ Método para determinar polifenoles totales: Este método fue originalmente diseñado para el análisis de proteínas, pero posteriormente fue adaptado por Singleton, Orthofer y Lamuela-Raventós (1999) para la cuantificación de compuestos fenólicos en vino, convirtiéndose desde entonces en una técnica rutinaria para la evaluación antioxidante de alimentos y extractos vegetales. El método de Folin-Ciocalteu permite estimar el contenido total de compuestos fenólicos presentes en extractos vegetales y formulaciones cosméticas. Basado en la reducción del reactivo de Folin Ciocalteu en un medio alcalino, generando una coloración azul cuya intensidad es proporcional a 40 la concentración de compuestos fenólicos. Los resultados se expresan como equivalentes de ácido gálico (GAE). (48) Preparación de reactivo: ✓ Ácido gálico 10 mg en 25 mL. ✓ NaCO3 al 20% en 25 mL. ✓ Folin – Ciocalteau 2 mL + agua destilada 2 mL = “W” Procedimiento para el extracto: • Se tomaron 150 µL de muestra o de las soluciones del estándar (ácido gálico en el caso de la curva de calibración). Se añadieron 850 µL de agua destilada. Luego se incorporaron 500 µL de agua destilada adicional, luego 250 µL de “W”. • Tras 5 minutos de reposo, se adicionaron 500 µL de solución de carbonato de sodio al 20% (m/v). La mezcla se incubó en la oscuridad por 90 min. La absorbancia fue medida a 760 nm, utilizando agua como blanco. La curva de calibración se elaboró con soluciones acuosas de ácido gálico, y los resultados se expresaron en µg equivalentes de ácido gálico (GAE) por µL de muestra. Figura 14. Proceso de disolución de la muestra de extracto para determinar polifenoles totales 41 ❖ Método para determinar flavonoides: La cuantificación de flavonoides totales se realizó siguiendo el método descrito por Zhishen et al. Este ensayo se fundamenta en una serie de reacciones químicas: inicialmente, los flavonoides reaccionan con nitrito de sodio (NaNO₂), posteriormente se forman complejos estables con cloruro de aluminio (AlCl₃) y finalmente se añade hidróxido de sodio (NaOH) para alcalinizar el medio. Como resultado se genera una coloración rosada, cuya intensidad es proporcional a la concentración de flavonoides presentes en la muestra. (49) Preparación de reactivos: ✓ Solución de NaNO2 al 5% (25 mL). ✓ Solución de AlCl3 al 10% (25 mL). ✓ Solución NaOH 1 M. Procedimiento para el extracto: • Se tomaron 800 µL de muestra o de las soluciones del estándar (quercetina en el caso de la curva de calibración). • Se añadieron 200 µL de agua destilada, y se homogenizó la mezcla. Luego, se realizaron las diluciones seriadas con 500 µL de etanol. De cada dilución se transfirieron 100 µL a viales ámbar, adicionando 500 µL de agua destilada. • Se agregaron, 75 µL de NaNO2 (5%) dejando reaccionar durante 5 minutos. Posteriormente, se añadieron 150 µL de AlCl3 (10%), dejando reaccionar por 6 minutos, verificando si ocurre alguna reacción. • Finalmente, se incorporaron 500 µL de NaOH (1M), manteniendo la reacción durante 30 minutos. La absorbancia se midió a 510 nm. Los resultados fueron expresados como mg equivalentes de Quercetina (QE) por cada 100 mg de muestra. 42 Figura 15. Proceso de disolución de la muestra de extracto para determinar flavonoides 2.5.8.4 Pruebas piloto: ➢ Selección de mejor solubilidad: Se realizó pruebas de solubilidad a los extractos, para determinar los solventes óptimos. ➢ Selección de capacidad antioxidante: Se realizó tres métodos para seleccionar la capacidad antioxidante de los extractos, y así llegar a la formulación cosmética adecuada. ➢ Selección del gelificante o agente gelificante: Se elaboraron formulaciones experimentales utilizando extractos de partes aéreas y flores de Encelia canescens, variando el tipo de agente gelificante con el fin de evaluar la compatibilidad, estabilidad y apariencia final del producto. De las seis formulaciones iniciales (F1–F6), se seleccionaron aquellas que mostraron mejor comportamiento organoléptico y estabilidad fisicoquímica, según se muestra en la Tabla 3. 43 Tabla 3. Evaluación de formulaciones para la selección del agente gelificante. (ANEXO 10) Nº FORMULACIÓN OBSERVACIONES CONCLUSIÓN F1 Gel con extracto de flores y base 1. Presentó buena homogeneidad, transparencia y estabilidad durante el periodo de observación. Aceptable F2 Gel con extracto de flores y base 2, Mostró comportamiento similar a la F1, con textura uniforme, buena transparencia y pH compatible. Aceptable F3 Gel con extracto de flores y base 3. Exhibió textura homogénea y adecuada consistencia, aunque presentó interferencias en la evaluación de la actividad antioxidante. Descartada F4 Gel base 5 en envase de vidrio transparencia, presencia de grumos y evaporación parcial y una posterior licuefacción del sistema, evidenciando inestabilidad en la formulación. Descartada F5 Gel con extracto de partes aéreas. Se evidenció separación de fases y formación de grumos, indicando inestabilidad fisicoquímica. Descartada F6 Gel con textura y extensibilidad adecuadas, pero con signos de inestabilidad asociados al agente gelificante. Descartada F7 Gel opaco, con baja extensibilidad y falta de homogeneidad, características indicadas de inadecuada gelificación. Descartada F8 Gel con base 4 en envase plástico. Mostró buena textura y viscosidad, pero se observaron puntos de aire en la estructura. Descartada F9 Gel base 5, en envase plástico. Presentó textura suave, ligera separación, se evaporó a los 2 días. Descartada F10 F8 pero en envase de vidrio, buena textura, sin grumos, pero opaco a los pocos días. Descartada *Las formulaciones F1 y F2 fueron consideradas aceptables por su homogeneidad, transparencia y estabilidad. 44 ➢ Selección de concentración de extracto Se procedió a formular a distintas concentraciones (7%, 10%, 13%, 15% y 20%) para así verificar si existe diferencia significativa. 2.5.9 Formulación del gel: (ANEXO Nº 11) Para esta formulación se usaron los datos de la pre-formulación, tanto el extracto que tenga mayor actividad antioxidante y mejor compatibilidad con los solventes. Se obtuvo la formulación final, a la cual, se le realizó las siguientes pruebas: 2.5.10 Controles de calidad: 2.5.10.1 Ensayos organolépticos (ANEXO Nº 12) Son procedimientos utilizados para evaluar las características de un producto detectable por los órganos de los sentidos. ▪ Aspecto: Se llevó a cabo una evaluación visual, se observó si la muestra presentó separación de fases, precipitaciones, nubosidad, etc (50). ▪ Olor: Se llevó a cabo mediante el sentido del olfato, la cual, se hizo uso de una tira para insertarla en un extremo de la muestra, después se retiró el papel para percibir el olor presente en el gel (50). ▪ Color: El color del gel se clasificó visualmente mediante el Munsell Book of Color (51). Esta elección proporciona una referencia visual estandarizada, alineada con las guías europeas (COLIPA/SCCS), que exigen evaluar la apariencia/color en estudios de estabilidad y control (52). Para la evaluación, se colocó una pequeña porción del gel sobre una luna de reloj limpia y seca, registrándose el tono observado. ▪ Homogeneidad: Se colocó una extensión de la muestra sobre un portaobjetos, el cual se ubicó sobre una superficie de color negro, y posteriormente se observó utilizando una luna (50). ▪ Textura: Se aplicó una porción sobre la piel limpia y seca para analizar su textura y facilidad de aplicación prestando atención a su absorción y comprobando si conservaba una consistencia fluida (52). ▪ Consistencia aparente: Para evaluar la consistencia de las formulaciones, se tomó una pequeña porción del gel y se comprimió suavemente entre el pulgar y el índice, 45 registrándose la resistencia al tacto y la sensación de cohesión percibida (53). ▪ Evanescencia (poder refrescante): Se aplicó una porción del gel sobre la piel a fin de evaluar la rapidez de evaporación o absorción cutánea (54). Estas cualidades organolépticas serán medidas a las 24 horas, 7, y 15 días, desde su preparación. 2.5.10.2 Ensayos fisicoquímicos (ANEXO Nº 13) ▪ Extensibilidad: Este método se basa en el aumento de la superficie de una determinada cantidad de muestra al ser sometida, progresivamente, a presiones crecientes a iguales intervalos de tiempo. El área de extensibilidad (AE) se determinó mediante la expresión: AE=π(rp)2 Donde 𝑟𝑝corresponde al radio promedio obtenido a partir de ocho mediciones independientes (mm). (55) Los resultados se expresaron como el promedio de tres réplicas experimentales, y posteriormente se construyó la curva de relación entre la masa aplicada (g) y el área de extensibilidad (mm²), con el fin de analizar el comportamiento deformacional del gel bajo carga. (56) ▪ Determinación de pH: Se realizó con la finalidad de especificar los iones hidrogenados en la formulación del gel, reaccionando ante una desestabilización de formulación. Para el ensayo, se pesó 1 g de la muestra de gel en un vaso de precipitados de 10 mL y se agitó durante 5 minutos a temperatura ambiente para asegurar la homogeneidad. Las lecturas se realizaron por triplicado y se registró el promedio. (57) ▪ Determinación de viscosidad: Se valora la resistencia que el gel ofrecerá, este parámetro ayuda a determinar si un producto presenta la consistencia o fluidez apropiada, se midió a 25 °C en un viscosímetro Brookfield hasta estabilizar la lectura. (53) 46 2.5.10.3 Prueba de estabilidad preliminar: (ANEXO Nº 14) La evaluación de estabilidad preliminar constituye una etapa esencial en el desarrollo de formulaciones cosméticas, orientada a determinar la robustez fisicoquímica inicial y detectar posibles incompatibilidades entre los componentes. Este ensayo permite optimizar la composición y garantizar la coherencia estructural y microbiológica del gel durante el periodo de observación, sin implicar una estimación de vida útil. (52) - Prueba de Centrífuga: Se evaluó la estabilidad coloidal sometiendo una alícuota del gel a 3000 rpm durante 30 min. La ausencia de separación de fases o formación de sobrenadante indicó buena estabilidad estructural. - Temperatura: Se evaluó la estabilidad térmica del gel bajo condiciones controladas de temperatura, mediante ciclos de calentamiento (40 ± 2 °C) y enfriamiento (5 ± 2 °C), observando posibles cambios fisicoquímicos o estructurales. - Ciclos de temperatura: El ensayo se prolongó durante 15 días, alternando cada 24 h entre 40 ± 2 °C (estufa) y 4 ± 2 °C (refrigeración). Se registraron variaciones organolépticas y fisicoquímicas en los días 0, 7 y 15, a fin de identificar signos de inestabilidad o degradación. 2.5.10.4 Control microbiológico: (ANEXO Nº 15) El control microbiológico es esencial para garantizar la calidad e inocuidad de geles cosméticos, permitiendo verificar la eficacia del conservante y el cumplimiento de los límites microbiológicos normativos (53). En este estudio, se realizó la cuantificación de la carga microbiana total y la detección de microorganismos patógenos, siguiendo lo establecido en el Capítulo 2, Artículo 4 de la Decisión 833 de la Comunidad Andina de Naciones (CAN) (58), en la cual menciona las especificaciones microbiológicas, que son las siguientes: 47 Figura 16. Especificaciones microbiológicas (58) Además, se consultaron los capítulos <61> y <62> de la Farmacopea de los Estados Unidos (USP 43) como referencia internacional complementaria para validar los métodos microbiológicos empleados, garantizando la confiabilidad y reproducibilidad de las determinaciones realizadas en el control de calidad del gel cosmético (59). Se pesaron 10 g de gel y se homogenizaron en 90 mL de solución salina estéril, obteniendo la dilución 10-1. A partir de esta, se realizaron diluciones sucesivas, las cuales fueron inoculadas en distintos medios, según el microorganismo a evaluar: Tabla 4. Ensayo microbiológico de control de calidad del gel cosmético ENSAYO / MICROORGANISMO MEDIO DE CULTIVO PROCEDIMIENTO LECTURA / INTERPRETA CIÓN Recuento de mesófilos aerobios totales Plate Count Agar (PCA) Se homogenizaron 10 g de gel en 90 mL de solución salina estéril (10-1) y se prepararon diluciones seriadas hasta 10-3. Se inoculó 1 mL en placas con 15-20 mL de PCA fundido (45 ºC) y se incubó a 30 – 45 ºC por 48 – 72 h. Colonias contadas y expresadas en UFC/g. Staphylococcus aereus Manitol Salado Agar (MSA) Se tomó 1 mL de la dilución 10⁻¹ y se sembró por estría en placas de MSA. Colonias amarillas con halo indican presencia. 48 Pseudomonas aeruginosa Agar Cetrimide Se tomó 1 mL de la dilución 10⁻¹ y se sembró por estría en placas de Cetrimide. Colonias verdes – azuladas fluorescentes indican presencia. Escherichia coli Agar MacConkey Se tomó 1 mL de la dilución 10⁻¹ y se sembró por estría en placas de MacConkey. Colonias rosadas con halo indican presencia. Fuente. United States Pharmacopeia (USP). Microbiological Examination of Nonsterile Products: Microbial Enumeration Tests <61>. In: USP 43 – NF 38. Rockville (MD): United States Pharmacopeial Convention; 2020. Figura 17. Esquema del procedimiento para el control microbiológico del gel cosmético 2.5.11 Métodos para determinar la actividad antioxidante al gel: (ANEXO Nº 16) Para determinar la actividad antioxidante del gel se emplearán 3 métodos: • Determinación de la actividad antioxidante mediante el método de reductora de iones cúpricos (CUPRAC) Procedimiento para el gel formulado: Para la preparación de la muestra, se disolvieron 300 mg del gel formulado en 2 mL de etanol 96%, obteniéndose la solución madre. A partir de esta, se realizaron diluciones sucesivas mediante la mezcla de 500 μL de la solución inicial con 500 μL de etanol 96%. El mismo protocolo que se utilizó con los extractos, se aplicó a las diferentes concentraciones de gel cosmético. 49 • Determinación de la actividad antioxidante mediante el método de reducción del hierro férrico a ferroso (FRAP) Procedimiento para el extracto: Para la preparación de la muestra, se disolvieron 600 mg del gel formulado en 2 mL de etanol 96%, obteniéndose la solución madre. A partir de esta, se realizaron diluciones sucesivas mediante la mezcla de 500 μL de la solución inicial con 500 μL de etanol 96%. El mismo protocolo que se utilizó con los extractos. • Determinación de la actividad antioxidante mediante el método la decoloración del catión radical 2,2-difenil-1-pierilhidrazilo (DPPH) (60) Procedimiento para el gel: Para la preparación de la muestra, se disolvieron 600 mg del gel formulado en 2 mL de etanol 96%, obteniéndose la solución madre. A partir de esta, se realizaron diluciones sucesivas mediante la mezcla de 500 μL de la solución inicial con 500 μL de etanol 96%. Posteriormente, en viales ámbar se adicionaron 725 μL de la solución de DPPH y 25 μL de cada dilución del gel, dejándose reaccionar en oscuridad durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las lecturas de absorbancia se realizaron en un espectrofotómetro UV-Vis a 517 nm, empleando etanol 96% como blanco. Cada determinación se llevó a cabo por triplicado. Los resultados se expresaron como porcentaje de inhibición del radical DPPH, y a partir de estos valores se calculó el IC₅₀, definido como la concentración de la muestra capaz de inhibir el 50% de la absorbancia del radical libre. % 𝐝𝐞 𝐈𝐧𝐡𝐢𝐛𝐢𝐜𝐢ó𝐧 = Abs blanco − Abs muestra Abs blanco x 100 50 Figura 18. Proceso de disolución de la muestra de gel para el método DPPH 2.5.12 DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE POLIFENOLES TOTALES Y FLAVONOIDES (ANEXO Nº 17) 2.5.12.1 Método para determinar polifenoles totales: (61) La cuantificación de polifenoles totales permite verificar la conservación de los compuestos antioxidantes en el gel, asegurar su estabilidad química y establecer una correlación directa con la actividad antioxidante, respaldando la calidad y eficacia del producto cosmético. Procedimiento para el gel:  Se pesaron 317,6 mg de gel formulado y se disolvieron en 2 mL de agua destilada. Se prepararon diluciones seriadas siguiendo el mismo procedimiento empleado para el extracto. La concentración final se expresó en mg/mL. 2.5.12.2 Método para determinar flavonoides: (62) La determinación de flavonoides totales en un gel antioxidante permite asegurar la preservación de compuestos bioactivos claves, establecer su contribución directa a la actividad antioxidante global y garantizar la estabilidad funcional del producto cosmético. De esta manera, su cuantificación no solo permite caracterizar el extracto de Encelia canescens L., sino también respaldar científicamente la eficacia dermocosmética de la formulación final. 51 Procedimiento para el gel  Se tomaron 3 g de muestra o de las soluciones del estándar (quercetina, para la curva de calibración).  Se añadieron 3 mL de agua destilada, y se homogenizó la preparación. La suspensión se centrifugó a 3000 rpm durante 5 minutos, para obtener un sobrenadante libre de interferencias. Del sobrenadante se realizaron diluciones seriadas con 500 µL de etanol. De cada dilución se transfirieron 100 µL a viales ámbar, adicionando 500 µL de agua destilada.  Se agregaron, 75 µL de NaNO2 (5%) dejando reaccionar durante 5 minutos.  Posteriormente, se añadieron 150 µL de AlCl3 (10%), dejando reaccionar por 6 minutos, verificando si presentaba alguna reacción.  Finalmente, se incorporaron 500 µL de NaOH (1M), manteniendo la reacción durante 30 minutos. La absorbancia se midió a 510 nm. Los resultados fueron expresados como mg equivalentes de Quercetina (QE) por cada 100 mg de muestra. 2.5.13 COMPARACIÓN DE ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE POR MÉTODO DE CUPRAC IN VITRO AL GEL COSMÉTICO FORMULADO A PARTIR DEL EXTRACTO HIDROALCOHÓLICO CON UN GEL ANTIOXIDANTE COMERCIAL: (ANEXO Nº 18) La comparación de la capacidad antioxidante in vitro entre el gel formulado y un gel comercial de referencia mediante el método CUPRAC permitió validar la eficacia funcional y el comportamiento redox de la formulación desarrollada. Este método, reconocido por su sensibilidad y aplicabilidad en matrices tanto hidrofílicas como lipofílicas, aseguró la obtención de resultados reproducibles bajo condiciones experimentales controladas. La evaluación comparativa frente a un producto del mercado constituyó un indicador objetivo de desempeño antioxidante, confirmando el potencial bioactivo del gel a base de Encelia canescens y su idoneidad para aplicaciones dermocosméticas orientadas a la protección cutánea frente al estrés oxidativo (60). 52 2.6 Técnicas de procesamiento de la información: Observación Se empleó la técnica de observación experimental para registrar de forma sistemática los resultados obtenidos, utilizando fichas diseñadas para consignar las mediciones y observaciones de los ensayos. Recolección de datos analíticos Los resultados generados por los distintos métodos experimentales (evaluaciones fisicoquímicas y determinaciones antioxidantes) fueron registrados en un cuaderno de trabajo, garantizando la trazabilidad y consistencia de la información recopilada. Procesamiento de datos La información se procesó en Microsoft Excel® y Word® (Office 365), calculando promedios y desviaciones estándar, y elaborando tablas y gráficos para la presentación de resultados. 2.7 Técnicas de Análisis e interpretación de la información Los datos experimentales fueron registrados en un cuaderno de laboratorio y posteriormente transferidos a Microsoft Excel® (Office 365) para su tabulación y análisis preliminar. Para la comparación estadística entre tratamientos o métodos de extracción, se utilizó el programa Statistica® 13, aplicando un análisis de varianza (ANOVA) de una vía, seguido de la prueba post hoc de Tukey (p < 0,05) para determinar diferencias significativas entre medias. Asimismo, para la representación gráfica y análisis visual de tendencias, se empleó el software GraphPad Prism® 10, lo que permitió una interpretación clara, objetiva y reproducible de los resultados experimentales. 2.8 Aspectos éticos El presente estudio se condujo conforme a los principios éticos de integridad científica, asegurando la veracidad, transparencia y trazabilidad de los datos obtenidos. Se evitó toda manipulación o sesgo de la información, cumpliendo las normas internacionales de redacción científica. Asimismo, se respetaron los derechos de autor y las normas de ética en investigación establecidas por la institución, garantizando la confidencialidad, reproducibilidad y fiabilidad de los resultados. 53 III. RESULTADOS Tabla 5. Metabolitos secundarios de las fracciones derivadas del extracto hidroalcohólico de las partes aéreas y flores de Encelia canescens L. “girasol silvestre” Leyenda: Presencia (+); Ausencia (-) FRACCIÓN METABOLITO SECUNDARIO REACCIONES EH PARTES AÉREAS EH FLORES A Taninos Rx. de Gelatina-sal - + Grupos fenólicos libres Rx. de cloruro férrico + + Aminoácidos Rx. de Ninhidrina + + Flavonoides Rx. de Shinoda + + B Esteroides y/o triterpenoides Rx. de Liebermann Burchard + + Antraquinonas Rx. de Borntager - - C Esteroides y/o triterpenoides Rx. de Liebermann Burchard + + Cardenólidos Rx. de Kedde - + Alcaloides Rx. de Dragendorff - - Rx. de Mayer - - Rx. de Wagner - - D Flavonoides Rx. de Shinoda - + Leucoantocianidinas y catequinas Rx. de Rosenheim + + Esteroides y/o triterpenoides Rx. de Liebermann Burchard + + Cardenólidos Rx. de Kedde - + Alcaloides Rx. de Dragendorff - - Rx. de Mayer - - Rx. de Wagner - - E Flavonoides Rx. de Shinoda + + Leucoantocianidinas y catequinas Rx. de Rosenheim + + F Saponinas Rx. de Espuma + + Antraquinonas Rx. de Bornträger - + 54 Tabla 6. Caracterización organoléptica de los extractos hidroalcohólicos obtenidos de las partes aéreas y flores de la especie Encelia canescens L. “girasol silvestre” EXTRACTOS MÉTODO DE EXTRACCIÓN PARÁMETROS OLOR COLOR ASPECTO EH PARTES AÉREAS MACERACIÓN Característico (ligeramente dulce) Verde oscuro Viscoso ASISTIDA POR ULTRASONIDO Suigéneris Verde marronáceo Viscoso EH FLORES MACERACIÓN Característico (con nota ácida) Naranja Líquido con consistencia fluida ASISTIDA POR ULTRASONIDO Característico Naranja con ligero matiz marronáceo Líquido con consistencia fluida 55 Tabla 7. Caracterización fisicoquímica de los extractos hidroalcohólicos obtenidos de las partes aéreas de la especie Encelia canescens L. “girasol silvestre” Tabla 8. Caracterización fisicoquímica de los extractos hidroalcohólicos obtenidos de las flores de la especie Encelia canescens Lamarck “girasol silvestre”. *El valor de actividad de agua (aw) obtenido (0.71 ± 0.01) indica una baja disponibilidad de agua libre, condición que garantiza la estabilidad microbiológica y fisicoquímica del material vegetal. PARÁMETROS EXTRACTOS HIDROALCOHÓLICOS DE LAS PARTES AÉREAS UNIDADES EXTRACCIÓN POR MACERACIÓN EXTRACCIÓN ASISTIDA POR ULTRASONIDO Sólidos totales 83,94 83,55 g/100g Sólidos solubles 43,7 43,2 °Bx (Brix) Cenizas 15 15 g/100g pH 5 4,19 - % rendimiento 15,56 51,76 % R PARÁMETROS EXTRACTOS HIDROALCOHÓLICOS DE LAS FLORES UNIDADES EXTRACCIÓN POR MACERACIÓN EXTRACCIÓN ASISTIDA POR ULTRASONIDO Sólidos totales 53 58,87 g/100g Sólidos solubles 1,6 % 1,3 % °Bx (Brix) Cenizas 0,99 % 0,65 % g/100g pH 4,18 4,12 - % rendimiento 61,54 64,44 % R Aw (flores secas) 0,71 - 56 Tabla 9. Ensayo de solubilidad de los extractos hidroalcohólicos obtenidos de la especie Encelia canescens L. “girasol silvestre” SOLVENTE EXTRACTO HIDROALCOHÓLICO DE LAS PARTES AÉREAS EXTRACTO HIDROALCOHÓLICO DE LAS FLORES E X T R A C C IÓ N P O R M A C E R A C IÓ N E X T R A C C IÓ N A S IS T ID A P O R U L T R A S O N ID O E X T R A C C IÓ N P O R M A C E R A C IÓ N E X T R A C C IÓ N A S IS T ID A P O R U L T R A S O N ID O Glicerina ++ ++ ++ +++ Aceite vegetal ++ + ++ + Agua destilada Tº ambiente + ++ ++ ++ Propilenglicol - - ++ + Agua a Tº 70 ºC ++ +++ +++ ++ Vaselina ++ + ++ + Alcohol 70º +++ ++ +++ +++ Alcohol 96º ++ +++ ++ ++ Leyenda: Muy soluble (+++), soluble (++), poco soluble (+), insoluble (-). 57 Análisis comparativo y determinación de la actividad antioxidante de los extractos por el método CUPRAC Tabla 10. Lectura de absorbancia de las disoluciones de patrón de Trolox por el método de CUPRAC Trolox mM Abs 1 Abs 2 Abs 3 Abs prom DS 0,96 0,313 0,312 0,315 0,313 0,0015 0,48 0,155 0,159 0,164 0,159 0,0045 0,24 0,090 0,094 0,097 0,094 0,0035 0,12 0,047 0,046 0,049 0,047 0,0015 0,06 0,018 0,022 0,027 0,022 0,0045 Figura 19. Curva de cuantificación de Trolox para la determinación de la actividad antioxidante por el método CUPRAC y = 0.3177x + 0.009 R² = 0.998 0.000 0.050 0.100 0.150 0.200 0.250 0.300 0.350 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 A b so rb a n ci a P ro m ed io Trolox mM Trolox - Patrón del método CUPRAC 58 Tabla 11. Capacidad antioxidante del extracto hidroalcohólico de partes aéreas de Encelia canescens L. “girasol silvestre”, mediante el método CUPRAC. Método de extracción Extracto mg/mL Abs 1 Abs 2 Abs 3 Abs prom DS TEAC mM Maceración 5 0,405 0,405 0,406 0,446 0,0006 1,25 2,5 0,169 0,171 0,171 0,192 0,0012 0,51 1,75 0,130 0,088 0,089 0,101 0,0240 0,29 Ultrasonido 5 0,446 0,449 0,446 0,446 0,0017 1,38 2,5 0,199 0,207 0,192 0,192 0,0075 0,60 1,75 0,102 0,106 0,101 0,101 0,0026 0,30 *TEAC: valores expresados en 1 mM, respecto al extracto expresado en mg/mL. Tabla 12. Capacidad antioxidante del extracto hidroalcohólico de flores de Encelia canescens L. “girasol silvestre”, mediante el método CUPRAC. Método de extracción Extracto uL/mL Abs 1 Abs 2 Abs 3 Abs prom DS TEAC mM Maceración 900 2,407 2,411 2,399 2,406 0,0061 7,54 450 1,322 1,326 1,329 1,326 0,0035 4,14 225 0,852 0,868 0,874 0,865 0,0114 2,69 112,5 0,491 0,498 0,498 0,496 0,0040 1,53 56,25 0,278 0,285 0,287 0,283 0,0047 0,86 Ultrasonido 900 1,977 1,987 1,986 1,983 0,0055 6,21 450 1,136 1,146 1,147 1,143 0,0061 3,57 225 0,722 0,73 0,735 0,729 0,0066 2,27 112,5 0,402 0,406 0,405 0,404 0,0021 1,24 56,25 0,248 0,25 0,259 0,252 0,0059 0,77 59 Figura 20. Correlación entre concentración del extracto hidroalcohólico de las partes aéreas de